Нарисованный в полный рост человек: D1 87 d0 b5 d0 bb d0 be d0 b2 d0 b5 d0 ba d0 bf d0 be d0 bb d0 bd d1 8b d0 b9 d1 80 d0 be d1 81 d1 82: стоковые векторные изображения, иллюстрации

Содержание

о чем психологам расскажет ваш аватар

Дожились, теперь «зеркало души» это не только глаза, но и аватар в социальных сетях. Толковому психологу он расскажет больше, чем откровенная беседа за чашечкой кофе с коньяком. В нашем случае таким специалистом стала преподаватель кафедры специальной клинической психологии ЧелГУ Елена Коба. 

Котики, щеночки, еноты и прочая «милота»

Каждое животное само по себе имеет определенные характеристики. Кошки, например, ласковые и независимые, а змеи — символы мудрости и величия. А вот миленькие маленькие создания (детеныши) с точки зрения психологии говорят о том, что людям, за ними спрятанным необходимы: ласка, забота, поддержка, любовь. 

Волки, львы и прочие хищники

Все, что касается хищных животных, это проецирование своих желаний и намерений. Здесь все просто, если хищник, изображенный на аватаре, настроен агрессивно, то значит, и с хозяином аватара происходит то же самое: его посещают какие-то скрытые (или явные) агрессивные мысли, злые фантазии. А еще такие люди нередко стремятся к одиночеству. 

Фентезийные персонажи: эльфы, гномы, феи…

Фентезийные, сказочные персонажи могут свидетельствовать о том, что хочет, чтобы его желания исполнились сами собой. 

Супер-герои

Их часто выбирают подростки, которые стесняются каких-то своих качеств, внешности и мечтают стать более уверенными в себе. Впрочем, за аватаркой супер-героя может скрываться взрослый, но не реализовавший себя человек. 

Фотографии из детства

Человек с собственным портретом 20-летней давности на аватарке, скорее всего, скучает по себе-маленькому. Он как бы показывает другим: смотрите, я не вырос, я все тот же ребенок, я такой же естественный и беззаботный, как и много лет назад. 

Совместное фото (муж с женой, девушка с парнем)

Тут все тоже крайне просто — демонстрация собственных отношений, собственной полноценности. Фактически, это признание ценности себя как мужчины или как женщины. Впрочем, такая демонстрация наглядно показывает, что только лишь собственной оценки человеку недостаточно. Он хочет, чтобы об этом знали все, чтобы видели, что он тоже как все, что у него есть любимый человек и что ему хорошо. 

Известные актеры, модели, певцы

Человек стремится быть инкогнито в интернет-пространстве, но при этом хочет, чтобы о нем сложилось определенное мнение. 

Селфи

Очевидно, что за «себяшка», поставленной на аву может скрываться самый настоящий нарцисс. При этом часто обладатели селфи-аватарок меняют изображения аккаунта гораздо чаще, чем остальные пользователи. Человек демонстрирует какой он, какой он может быть, в каких он ракурсах, в каких ситуациях, какие у него эмоции.

Значок, символика, пиктограмма, логотип

Логотипы как таковые крайне распространены на аватарках — это способ продвижения товара или услуги. Другое дело, когда человек сам изготовил (нарисовал) какой-то символ и установил его как главное фото аккаунта. Это говорит о неординарности автора, о том, что человек готов выйти за границы каких-то общепринятых рамок и штампов. 

Однотонная заливка

Загадочность. Но уже не такая, как у обладателей аватарок со знаменитостями. Ты не знаешь, кто я, ты даже не догадываешься, кем я могу быть, как бы говорит автор такой аватарки. 

Черно-белые снимки (свои или чужие)

Человек пытается что-то скрыть от окружающих, но при этом хочет быть раскрытым. Черно-белые фото предлагают не только два цвета (черный и белый), но и, как в том кино, многообразие оттенков серого. Кроме того, обладатель черно-белой аватарки зациклен на прошлом, на своих собственных переживаниях прошлых лет. 

Части тела (глаз, рука, нога)

Чаще всего руки и ноги (отдельно от тела, либо тело отдельно от головы) используют для аватарок женщины. Таким образом, они как бы выделяют те части тела, которые им нравятся. Такое выделение одной части тела заставит вашего собеседника что называется кликнуть — зайти и посмотреть, что же там целиком. Если же на аватарке тело в полный рост, да еще и обнаженное, то с очень большой вероятностью за аватаркой спрятался мужчина. 

Гримасы, рожицы и шаржи

Если человек скорчил рожу и не постеснялся сделать такое фото аватаром своего аккаунта, значит он смелый и веселый, легкий на подъем и общительный, уверенный в себе и добрый. Такие люди, как правило, хорошие интересные собеседники. 

Пляжные фото

«Посмотрите, насколько я успешен» — вот девиз обладателя пляжной аватарки. Человек (как и в случае с совместным аватаром) демонстрирует свой стиль жизни. Чаще всего это не постоянный стиль (фото, как правило, делаются во время отпуска), но хозяин аватарки тем не менее хочет, чтобы так было всегда. 

Отсутствие аватара

Человек явно в поиске. Он не открыт и, вероятно, не готов к большому количеству собеседников в социальных сетях. Ему не нужны ни высокая посещаемость его страницы, ни приглашения в сообщества или добавления в друзья. Дефицита в общении он не испытывает.

Где живет птица Кецаль? — отзыв о Пирамида Кукулькана, Чичен-Ица, Мексика

Первое, на что натыкаешься в Чичен-Ице, это, конечно, пирамида Кукулькана. Самая известная, пожалуй, во всей Мексике. Какой отзыв ни прочитаешь, какой рисунок ни посмотришь, всюду она. Поэтому, как ни крути, а сфотографироваться на её фоне я был просто обязан.
— Киса и Ося были тут! — бормотал я, позируя на фоне зелёной лужайки перед грандиозным сооружением древности и подставляя под хороший ракурс свою волшебную беленькую футболочку с надписью «Я тут был». А нарисованный на вершине пирамиды Кукулькан смотрел на меня и ещё сотню таких же, как я, и думал, небось, о чём то о своём, божественном и возвышенном.
Кукулькан — одно из главных божеств в культуре майя, рисовался в виде змея с человеческой головой и покрытый перьями птицы Кецаль. Вот, что я знаю! Он был богом ветра, дождя, покровителем планеты Венеры, основателем чуть ли не десятка достопочтенных индейских родов и ещё много, много чего. Многостаночник, одним словом.
Рассмотреть нарисованное божество в полный рост у нас не получилось. По причине того, что находится пернатый змей на самой верхотуре, а нас, простых смертных, к нему на аудиенцию не пускают. Пирамида огорожена музейной ленточкой по периметру, и заходить за неё не смей. Причём зайти то за ограждение можно легко, но вот карабкаться по склону никто не решался. Нельзя, так нельзя.
Зато уютно расположившись на зелёной полянке под тёплым мексиканским солнышком, мы с женой минут двадцать вели научный диспут по поводу принадлежности и качества перьев этого самого волшебного змия. Лично для меня всё разложено чётко. Раз зверь пернатый, значит все тело рептилии покрыто перьями. Короче, змей лохматый как птичка, но без крыльев. У жены же, как всегда, имелось своё собственное мнение:
— А почему змей пернатый? Таких не бывает. Мне кажется, что змей оперившийся!
—?!! А в чём разница?
— Ну как ты не понимаешь. Змеи изначально, как им и положено, рождаются с кожей змеиной. А этот полазил где-то под радиоактивным камушком, у него произошла мутация, вот он и оперился! То есть он не сразу был таким, а залохматился потом… Понятно? Понятно, что же тут непонятного. А согласитесь, версия весьма жизненная! Осталось только выяснить, где стоял Чернобыль былых лет.
Теперь несколько слов о таинственной птице Кецаль. Естественно, видели её немногие. Десятка с два жрецов, вошедших в транс с помощью снадобий с сушёными мухоморами, да пара героев-вождей, ушедших в нирвану после хорошенького удара по крепкому черепу вражеским каменным топором. Но все они рисуют пташку до коликов похожую на нашу родную «синюю птицу удачи, птицу цвета ультрамарин». Непременно изумрудного оперения, не дающуюся в руки и в неволе не размножающуюся.
Мы её тоже не видели. Врать не буду. Зато слышали, как она курлыкает. Если подойти к пирамиде Кукулькана, встать напротив лестницы и громко хлопнуть в ладоши, то птица услышит тебя и ответит разлаистым эховым кряком. Я пробовал. Ей-ей, отвечает! Чем угодно клянусь, это точно птица откликается!
Мне, как истинно русскому, этого показалось мало. Тут же созрел вопрос:
— А если гаркнуть во всё горло, что будет? Отзовётся она или испугается и заткнётся? А если не одному, а целой толпой?
Жена посмотрела на меня, как на идиота и тихонько отошла в сторону. Типа: «господа иностранные туристы, я не с ним. Он сам по себе дурак.» Я всё понял и птицу Кецаль пугать не стал. Но вопрос остался!..
Само собой очень интересовало, а что внутри пирамиды? Просто гора камней, или там что-то есть? Но музейный принцип: смотреть смотри, а руками не трогай, не позволил нам заглянуть вовнутрь. Хотя рассказывали, что в глубине большого Кукулькана скрывается ещё одна точно такая же пирамидка. Поменьше. По системе матрёшек. Напущали мистики, вроде загадка, для чего строители так сделали. Да всё очень просто! Построили пирамиду. Посмотрели, поглядели. Маловато будет! Нет должного размаха и величия. И чтобы боги остались уж совсем довольными, по-быстрому вокруг уже готовой пирамиды состряпали более грандиозный аналог. Вот и вся разгадка. Просто и чисто по-человечески.

Чудо фаюмских портретов

Интереснейший материал о загадочных фаюмских портретах — из блога nikolai-endegor.livejournal.com.

Когда впервые видишь эти портреты, которым без малого две тысячи лет, кажется, что столкнулся с настоящим чудом. Как это? за 5 веков до византийских ликов? за 10 веков до романского искусства? за 15 веков до Возрождения? Они же совсем живые!

Открытие

В 1880-х годах грабители древнеегипетских могил нашли близ оазиса Эль-Фаюм необычные портреты на деревянных досках, с поразительной достоверностью передававшие черты умерших людей. Каждый был вставлен в покровную ткань мумии на место лица, а под бинтами лежала табличка с указанием имени человека, его возраста и занятий. Расхитители вырвали портреты, таблички же были ими брошены и почти все погибли.

Предприимчивый венский антиквар Теодор Граф приобрел часть найденных досок у египетских перекупщиков и в 1887 году показал их на выставках в Берлине, Мюнхене, Париже, Брюсселе, Лондоне и Нью-Йорке.

Так мир узнал о портретах, получивших название фаюмских. Впоследствии похожие живописные работы стали находить и в других районах Египта, но первое название стало собирательным, и все портреты продолжают называть по имени далекого оазиса на границе ливийской пустыни.

Несколько портретов из коллекции Теодора Графа находятся в Венском музее истории искусств. Вот один из них, изображающий смуглого мужчину с вьющимися волосами и пронзительным взглядом:


Мужской портрет. Фаюм, Египет, 161-192 гг. н.э. Музей истории искусств, Вена

В том же 1887 году в Хаваре, на южной оконечности Фаюмского оазиса, работала экспедиция английского археолога Флиндерса Питри. Ему удалось обнаружить еще 80 портретов, некоторые из которых можно смело отнести к шедеврам мировой живописи, настолько они выразительны:


Женщина в красной тунике. Хавара, Египет, 110-130 гг. н.э. Национальный музей Шотландии, Эдинбург

Следует сказать, что фаюмские портреты, найденные в конце XIX века, не были первыми египетскими погребальными образами, ставшими известными в Европе. В далеком 1615 году итальянский путешественник Пьетро делла Валле привез из Египта три мумии, две из которых были с портретами. Затем в 1820-е годы через Генри Солта, британского консула в Каире, в Европу попали еще несколько портретов, один из которых был приобретен Лувром:


Женский портрет. Фивы, Египет, 2-я половина II в. н.э. Лувр, Париж

Этот портрет находился в зале египетских древностей Лувра с 1826 года, все посетители его видели, но… мало кто замечал. Понадобился перелом в изобразительном искусстве последней трети XIX века, появление новых живописных течений, в особенности импрессионизма, чтобы сознание современников оказалось готово к принятию фаюмских портретов не как забавного курьеза, но как явления мировой культуры.

Одной из важных точек в этом процессе стало открытие Ричардом фон Кауфманом так называемой Могилы Алины. Это произошло в 1892 году в Хаваре. В небольшой гробнице археолог обнаружил восемь мумий, три из которых — женщина и два ребенка — были с портретами. Из греческой надписи стало известно, что женщину звали Алиной и скончалась она в возрасте 35 лет. Реалистичность этого портрета поражает, а техника исполнения такова, что, не зная даты создания, его вполне можно было бы отнести к XIX веку.


Портрет Алины. Хавара, Египет, 24 г. н.э. Египетский музей, Берлин

Откуда мы?

К настоящему времени известна уже почти тысяча фаюмских портретов, треть из которых найдена в окрестностях Эль-Фаюма, а остальные обнаружены в других районах Египта. Все они датируются I-III веками нашей эры. Как создавались эти необычные изображения? Почему именно в Египте? Почему в начале нашей эры? Короткий ответ состоит всего из нескольких слов: так совпало. Три культурных источника соединились вместе и образовали новый поток.

1. Греческие корни

В IV веке до нашей эры Египет был завоеван Александром Македонским. После его смерти царем Египта стал ближайший друг Александра Птолемей, потомки которого правили страной более трех веков. При Птолемеях Египет вновь обрел утраченное ранее могущество, при этом правящий класс во многом стал греческим, а эллинизм широко распространился по всей стране. Как раз в это время греческая живопись достигла своего расцвета: объем научились передавать светотенью, использовались линейная и воздушная перспективы, развивалась колористика. Поэтому с определенностью можно сказать, что изобразительная традиция фаюмских портретов имеет греческие корни.

К сожалению, эллинистическая живопись до нас не дошла. Все знают греческую скульптуру, но ни картин, ни портретов греческих художников не сохранилось. Все, что мы знаем об этом искусстве, — это описания историков и римские копии отдельных работ. Одним из самых знаменитых греческих художников был современник Александра Македонского Аппелес, он первым начал рисовать портреты и ему единственному царь доверял рисовать себя. До нас дошла римская фреска, которую считают копией одной из работ Аппелеса, представляющей гетеру Фрину в образе Афродиты:


Афродита Анадиомена, I в. н.э. Дом Венеры, Помпеи

О другом известном греческом портрете мы также можем судить лишь по римской копии, «законсервированной» в Помпеях пеплом Везувия во время извержения 79 г. н.э. Эта мозаика изображает битву Александра Македонского с персидским царем Дарием, она считается копией картины греческого мастера Филоксена, жившего в IV до н.э. (существует, впрочем, мнение, что автором картины был Аппелес).


Александр Македонский. Фрагмент мозаики из Помпей, I в. н.э. Национальный археологический музей, Неаполь

Главной техникой, которая пришла в Египет из Греции и использовалась в фаюмских портретах, была энкаустика — живопись окрашенным воском. Работа выполнялась расплавленными восковыми красками с использованием не только кистей, но и лопаточек, и даже резцов. Исправления были практически невозможны, все в картине должно быть сделано правильно с первого раза. Писали чаще всего на дереве, реже на ткани. Считается, что энкаустика была изобретена еще в Древней Греции, откуда распространилась по всему античному миру, но первыми дошедшими до нас образцами стали именно фаюмские портреты.

2. Римское влияние

Греческий портрет всегда был условным и идеализированным. В классической Греции индивидуальность в изображениях реальных людей никогда не подчеркивалась и даже напротив — воспрещалась, чтобы в гражданах не развивалось тщеславие. Герои прославляли не себя, а свои города-государства, знаменитые атлеты представлялись идеальными статуями. Реалистическое направление развилось лишь в эллинистический период после походов Александра. Но и тогда в основе портрета оставалось не лицо, а вся фигура, «человек вообще», изображаемый в полный рост.

Древнеримская традиция была иной. Здесь развитие портрета было связано с усилением интереса к конкретной личности со всеми ее особенностями. В основу римского портрета (прежде всего скульптурного) была положена тщательная натуралистическая передача индивидуальных черт персонажа. Римляне верили в себя и считали человека достойным уважения в том виде, какой он есть, без приукрашивания и сокрытия физических недостатков.

 От скульптурных изображений в полный рост они перешли к бюстам, поскольку по представлениям кельтского и италийского мира жизненность и личность сосредоточены в голове, и достаточно изобразить только ее, чтобы выразить всего человека.


Терентиус Нео и его жена. Фреска из Помпей, 55-79 гг. н.э. Национальный археологический музей, Неаполь

Древнеримская портретная живопись, переняв у греческих мастеров передачу объема и композиционные приемы, внесла в их систему новые черты. Это прежде всего персонификация, внимание к чертам лица, обогащение колорита, свободная манера, сохраняющая характер эскизного наброска. Эти особенности хорошо видны и в фаюмских портретах. Неслучайно они появились на рубеже нашей эры, поскольку именно в это время эллинистический Египет был завоеван Римом (30 г. до н.э.) и превратился в одну из провинций Римской империи. Правящая верхушка Египта постепенно становилась римской, а культура метрополии, включающая и живописные стили, начала господствовать и в ее провинции.

3. Египетские традиции

При всех своих эллинистических и римских чертах, фаюмские портреты все же остаются глубоко египетскими по своему духу, поскольку это прежде всего портреты погребальные.

Культ мертвых существовал в Египте с глубокой древности. Одна из его основ — это понятие о бессмертной душе-двойнике человека, которая живет в загробном мире, но может возвращаться в захороненное тело. И очень важно, чтобы душа свое тело узнала. Для этого умерших мумифицировали и сохраняли, для этого мумии снабжали спрятанными табличками с именами, для этого же использовались погребальные маски и портреты.


«Запасная голова». Египет, 2609-2584 гг. до н.э. Венский музей истории искусств

Это одно из самых старых портретных изображений человека. Во времена Хеопса такие головы клали в гробницу невдалеке от мумии хозяина, чтобы душа могла вернуться в нее в случае повреждения мумии или, возможно, чтобы узнать «свое» тело. Более поздние погребальные египетские маски не только несли в себе черты реального человека, но и являлись образом его души и астрального духа. Поэтому они имели идеализированные черты, являясь как бы лицами вечности.


Погребальная маска, Египет, 1400-1300 гг. до н.э. Лувр, Париж

По верованиям египтян, часть души человека, называемая Ка, после смерти должна была видеть погребенные вместе с телом любимые домашние вещи, жертвоприношения, еду и питье, чтобы «пользоваться» всем этим в загробной жизни. Другая часть души, Ба, путешествовавшая по загробному миру, покидала тело через рот, а возвращалась через глаза. Для этого на саркофаге или на стене гробницы обязательно делали изображение покойного с открытыми глазами (страшной местью было замазать глаза на таком образе…). Поэтому далеко не случайно, что глаза на фаюмских портретах так проработаны и подчеркнуто выделены. Это не желание приукрасить человека, а необходимая черта ритуала, без которой портрет не мог бы выполнять свои основные функции. И также неслучайно, что глаза на этих изображениях смотрят не на зрителя, а сквозь него — это взгляды в вечность, в иной мир.


Портрет мужчины. Антинополь, Египет, 190-230 гг. н.э. Лувр, Париж

Фаюмские портреты захоранивались вместе с мумией изображаемого ими человека. Это по-видимому и стало главным фактором, позволившим нам любоваться этими творениями через много веков после их создания. Сухой климат Египта и стабильная атмосфера закрытых гробниц сохранили нежную восковую живопись, не дали разрушиться ее деревянным и тканым основам.

Кто мы?

Удивительно, но фаюмский портрет, похоже, не связан с какой-либо конкретной категорией населения. Этническое, социальное и даже религиозное происхождение персонажей очень разнообразно: тут есть египетские жрецы, иудеи и христиане (несмотря на протесты, египетские христиане бальзамировали своих покойников), высокопоставленные римские чиновники и освобожденные рабы, спортсмены и военные герои, эфиопы и сомалийцы… Однако было бы неверно верить в своеобразное «обращение» этих людей в египетскую религию. Скорее можно говорить о принятии ими определенных идей, которые происходили из египетских погребальных обрядов, и следовании традициям страны проживания.


Портрет женщины, называемой «Европейка». Антинополь, Египет, II в. н.э. Лувр, Париж

Скорее всего, эта женщина была достаточно богатой римлянкой. Она одета в фиолетовую тунику и желтый плащ, который крепится круглой брошью с большим изумрудом. Ее уши украшены серьгами, каждая из которых состоит из темного камня, вставленного между двумя крупными жемчужинами. Под золотым листом, нанесенным на шею, лабораторный анализ выявил жемчужное ожерелье. Сияние золота, напоминающее солнечный свет, сделало для египтян этот металл символом бессмертия. Поэтому золотые листки или вставки часто использовали для погребальных портретов, покрывая ими фон вокруг головы, рамку вокруг портрета или, как здесь, часть одежды.
Фаюмские портреты писались с живых людей, причем делалось это, когда человек был в достаточно молодом возрасте, можно сказать в расцвете своих сил. После этого портрет мог многие годы находиться в доме хозяина. Археолог Питри находил в домах рамки для портретов и портреты с подвесами. После смерти человека изображение вкладывалось в бинты мумии, часто на него наносили через трафарет золотой венок — типичный погребальный атрибут греков.


Портрет юноши. Египет, первая половина II в. н.э. ГМИИ им. Пушкина, Москва

По-видимому, исключением из правила письма портретов с живой натуры были детские образы. Многие из них создавали уже после смерти ребенка…


Портрет мальчика. Антинополь, Египет, конец II — начало III века н.э. Лувр, Париж

Некоторые фаюмские портреты имеют достаточно точную датировку. Помимо научных способов, время их исполнения помогли установить прически. Мода в римском обществе играла большую роль. Эпоха правления каждого императора отмечалась своим стилем. Мужчины подстраивались под императора, а императрица или другая представительница императорского дома изобретала особую, только ей свойственную прическу, которую копировали женщины. Образцы новых причесок привозили в Египет в виде моделей-головок.

Например, мужской портрет из венского Музея истории искусств датирован временем правления Марка Аврелия. Сравните его с бюстом императора:

А вот портрет молодой женщины, скромная прическа которой достаточно типична для периода правления императора Адриана (117-138 н.э.):


Женский портрет. Антинополь, Египет, II в. н.э. Лувр, Париж

Этот портрет не отделяли от мумии, в которую он вставлен. Рентгенологический анализ показал, что покойная была сорокалетней женщиной, а не молодой, как на портрете, т.е. датой создания мумии является примерно середина II века.


Женская мумия с портретом. Антинополь, Египет, II в. н.э. Лувр, Париж

Мумия эта лежит за стеклом витрины Лувра так, что ее очень трудно сфотографировать вместе с «лицом», поэтому снимок ее в полный рост я привожу с сайта музея. По-видимому, для этого мумию вынимали из витрины.


Женская мумия с портретом. Антинополь, Египет, II в. н.э. Лувр, Париж

На груди женщины видна греческая надпись ΕΥΨΥΧΙ ΕΥΔΑΙΜΟΝΙ, написанная черными чернилами. Трактовки ее разнятся, одни авторы читают надпись как «Прощай, будь счастлива», другие считают второе слово («Эвдаймон») именем умершей.

На портретной доске, впелёнутой в бинты, видны косые следы от пилы над плечами женщины рядом с ее шеей. Это характерная деталь для работ из Антинополя: здешние портреты, как и в других местах, писались на прямоугольных досках, но перед пеленанием их верхнюю часть подрезали с боков, чтобы доска лучше вписывалась в форму мумии.

Еще один портрет из этого региона, также подрезанный на уровне плеч:


Портрет молодой женщины. Антинополь, Египет, 130-150 н.э. Лувр, Париж

Художник умело использовал плотность воска, укладывая его в штрихи, которые следуют за формой лица, кривыми бровей. Эта же техника хорошо видна и на портрете Европейки, где восковые мазки еще более тонкие и выпуклые. Интересно, что на том портрете ресницы не прорисованы, а прорезаны: в нужных местах воск соскоблен острым инструментом до нижнего слоя черного грунта.


Портрет жреца. Хавара, Египет, 140-160 гг. н.э. Британский музей, Лондон

Этот образ был найден Флиндерсом Питри при раскопках в Хаваре. На нем изображен жрец культа бога Сераписа, чьей отличительной особенностью была диадема с семиконечной звездой — символом семи небесных тел. Серапис был эллинистическим богом изобилия, подземного царства и загробной жизни. Его обычно изображали как греческого бога, но с египетским атрибутами.


Портрет Аммониоса, Египет, III в. н.э. Лувр, Париж

Этот портрет написан не на доске, а на ткани, являющейся частью погребального савана. Он интересен своими деталями. В одной руке молодой человек держит богатый кубок с вином, в другой — «венок Осириса», гирлянду цветов, символизирующую его очищение от грехов. Слева от шеи нарисован желтый знак Анх — символ жизни, а справа — маленькая статуя божества, скорее всего Осириса. В углу ворота белой туники видны две маленькие фиолетовые линии, которые характеризуют точность работы художника: на многих туниках, найденных в египетских гробницах, места соединения ткани у ворота стягивались несколькими стежками красной, синей или пурпурной шерсти.

Куда мы идем?

К III веку н.э. трудоемкая энкаустика при написании фаюмских портретов постепенно начинает заменяться темперой, где в качестве связующего вещества красок используется не воск, а яичный желток и вода. Но изменения происходят не только в упрощении техники письма, но и в самом стиле изображений: их телесная реалистичность словно начинает угасать, объёмность форм сменяется плоскостной декоративностью.


Портрет молодой женщины. Мемфис, Египет, 2-я половина II века н.э. Лувр, Париж

Происходит отказ от идеалов античного реализма, художники все больше предпочитают схематические и символические изображения. По-видимому, многие портреты уже не писались с натуры. В поздних фаюмских портретах усиливается условность в трактовке лица и одежды, возрастает роль силуэтности.


Женский портрет. Фивы, Египет, III в.н.э. Лувр, Париж

Таким тенденциям находят достаточно разные объяснение. Одни авторы полагают, что погребальные портреты ставятся на поток, становятся скорее ремеслом и лубком, чем искусством. Другие считают, что с развитием религиозных представлений на первый план выходит не художественный образ, а богословская идея, все больше сближающая новый стиль с иконописью. Иногда фаюмские портреты даже называют «иконами до иконописи» — ведь древние художники стремились изобразить не просто внешний облик умершего, но его вечную душу.


Портрет мужчины. Фивы, Египет, середина III в.н.э. Лувр, Париж

Так или иначе, но закономерность не случайна: в тогдашнем мире происходил огромный исторический перелом. Римская империя постепенно рушилась под натиском варваров, центр духовности и силы перемещался с запада на восток, а христианство становилось наиболее распространенной религией.

В 313 году император Константин признал христианство государственной религией империи, а в 395 году Египет стал частью Византии. С этого времени и на долгие столетия живопись входит в двумерный мир. Кто-то называет это потерей третьего измерения, кто-то — обретением четвертого, в котором картина обладает божественными качествами того, кого она представляет. Фаюмские же портреты постепенно исчезают, поскольку христианство прекращает египетскую практику бальзамирования тел, а техника энкаустики забывается.

Так куда же они шли?


Дарий III, фрагмент копии греческой картины IV в. до н.э.; Портрет Алины, Фаюм I в. н.э.; Женский портрет, Фаюм, III-IV в. н.э.

Можно только догадываться, каких высот достигало греческое и римское изобразительное искусство. Скорее всего, фаюмские портреты — это не расцвет древней живописи, а ее закат — последнее дыхание уходящей античности перед началом ее вечной жизни.

Или, может, так?


Портрет жреца, Фаюм, II в. н.э.; Христос Пантократор, Константинополь, VI в. н.э.

Фаюмский портрет — предтеча и во многом источник византийской культуры. Это лики, которые перешагнули порог вечности и стали символами как поиска Бога, так и воссоединения с ним. Взгляд их огромных глаз, устремленный сквозь зрителя, познал нечто недоступное живым и передал это всему христианскому искусству.

Или…


Женщина в красной тунике. Фаюм, II в.; Кес ван Донген, Портрет блондинки, XX в.

…фаюмский портрет — это древний импрессионизм, в котором проявилась передача художниками своих мгновенных впечатлений. Начало импровизационных техник, развитие культуры мазка, системы добавочных тонов и красочных лессировок, повлиявшее на живопись XX века.

А может быть…


Женский портрет, Фаюм, II в. н.э.; Незнакомка из музея Орсэ, 2016 г.

…не нужно никаких теорий, а достаточно оглянуться по сторонам и увидеть ожившие портреты рядом с нами? Взгляд этой девушки, скользнувший мимо меня в бесконечность, явился тем толчком, который привел к появлению этой записи.

Фотографии из Лувра и Венского музея истории искусств — автора, остальные взяты с сайтов указанных музеев или из Википедии.

Из: nikolai-endegor.livejournal.com

Приложение рентген через одежду

Мечта многих — смотреть с помощью социального приложения и камеры в телефоне рентгеном сквозь одежду других людей. И даже в интернете можно найти такие инструменты, которые по словам их разработчиков, позволяют это всё реализовать.

Но возможны ли это на самом деле? Любой человек, кто хоть немного разбирается в технологиях, должен понимать, что для просмотра сквозь что-то, нужно специальное дорогостоящее оборудование, которым не оснащён ни один мобильный телефон. И эту возможность нельзя реализовать просто на программном уровне, имея в распоряжении лишь обычную камеру смартфона. Поэтому через камеру смартфона обычно можно увидеть только то, что видит глаз и не более того.

Ниже мы приведём список приложений-рентгенов, которые показывают сквозь одежду, но относиться к ним следует как к шутке, а не на полном серьёзе. Да, вы сможете с этим весело провести время с друзьями, но увидеть чью-то наготу не получится.

Body Scaner — взгляд сквозь одежду через камеру

Большинство приложений «рентгенов» и им подобным распространяются с целью заработка на рекламе. Поэтому в Body Scaner рекламы будет очень много. Вам следует быть внимательным, чтобы случайно не нажать на рекламу и не уйти из этого приложения куда-то ещё.

Суть программы проста — фотографируете на камеру человека в полный рост и накладываете на его тело изображение другого тела, которое в нижнем белье. Таким образом создаётся иллюзия взгляда сквозь одежду. Фото человека в полный рост можно загрузить и из галереи, а не через камеру.

  1. Скачайте приложение для Android и установите на своё устройство.
  2. Запустите приложение. На стартовой странице выберите Take Photo, чтобы добавить изображение из фотокамеры, либо Choose from gallery, чтобы загрузить картинку из галереи.
  3. Продолжим на примере добавление картинки из фотоаппарата. Нажмите Take Photo и наведите объектив смартфона на человека так, чтобы он поместился в камере в полный рост.
  4. Используйте фото полуобнажённого торса. С помощью касаний наложите это на человека в объективе. Если изображение торса не подходит, то замените его, нажав на Choose body.
  5. Вы можете пользоваться инструментом зеркального отражения, а также изменения размера изображения торса, чтобы попытаться подстроить всё максимально естественно.
  6. Когда всё готово, нажмите кнопку Ok, чтобы сфотографировать и сохранить результат.

Body Simulator Scanner — сканер сквозь одежду для мужчин и женщин

Body Simulator Scanner отличается тем, что он может «подглядывать» сквозь одежду и за мужчинами, и за женщинами. А работает примерно так же, как и описанное выше приложение — накладывается на фото человека изображение полуобнажённого тела в нижнем белье.

Вам может быть это интересно: Как залезть в телефон жены со своего телефона.

У приложения есть возможность добавлять фото людей как из галереи, так и через камеру. Но второй вариант по каким-то причинам не работает на некоторых устройствах. Вероятно, разработчики устранят эту проблему в будущих обновлениях. А также при использовании Body Simulator Scanner приготовьтесь к большому количеству рекламы — всё-таки, это не серьёзная программа.

  1. Скачайте Body Simulator Scanner на своё устройство под управлением Android.
  2. Запустите программу, и нажмите Start.
  3. Выберите пол человека, фото которого вы хотите обработать: Male — это мужчины, Female — женщины и нажмите на стрелку вверху справа.
  4. Выберите оттенок кожи человека и нажмите на стрелку вверху справа.
  5. Отметьте, какую часть тела вам нужно обработать — верхнюю (Uper-body) или нижнюю (Lower-body).
  6. Выберите обработку передней (Front-body) или задней (Back-body) части тела.
  7. Нажмите на кнопку галереи для загрузки картинки и выберите фото в галерее.
  8. Увеличивая, уменьшая и поворачивая изображение, сориентируйте силуэт фигуры, нарисованный пунктирной линией так, чтобы она максимально совпадала с фото.
  9. Нажмите на стрелку вверху справа.
  10. Теперь начните стирать пальцем изображение, убирая оригинальную картинку, пока не появится изображение полуобнажённого наложенного тела.

Six Pack Abs Scanner Prank — как увидеть пресс любого человека

Приложение позиционируется разработчиками как способ увидеть голый пресс любого человека. Умеет обрабатывать только область живота на фото. Изображение можно загрузить с помощью фотокамеры устройства или из галереи.

  • Скачайте приложение для iOs и установите на своём устройстве.
  • Запустите его и загрузите изображение человека через камеру или галерею. Нужен такой ракурс, чтобы в кадре хорошо была видна область пресса.
  • Наложите один из шести вариантов атлетических прессов на данное фото и сохраните его.

Выше мы рассмотрели несколько проверенных вариантов приложений «рентгенов», которые видят сквозь одежду. Проверенных, значит что они не являются вирусами и вымогателями, и безопасны в этом плане. Но следует понимать, что большинство таких и аналогичных программ распространяются именно с целью мошенничества. Поэтому будьте осторожны.

Пыльные лики вождей – Газета Коммерсантъ № 206 (3782) от 09.11.2007

Выставка фото

В галерее «Зураб» открылась выставка «Пространство революции: Россия. 1917-1941», представляющая работы официального фотографа ленинского и сталинского Кремля Петра Адольфовича Оцупа. В лица руководителей советского государства и раннесоветской элиты вглядывался ГРИГОРИЙ Ъ-РЕВЗИН.

Выставка, подготовленная Московским музеем современного искусства (кураторы Евгений Березнер, Наталья Тарасова, Ирина Чмырева), представляет 142 фотографии Петра Оцупа. Это очень качественный проект, что для фотовыставки означает две вещи — все представленные на ней отпечатки старые, сделаны самим Оцупом, и, кроме того, к выставке издан научный каталог. Старые, довоенные отпечатки размером 60х80 см, самим автором наклеенные на паспарту и снабженные его собственноручными подписями,— это высший шик коллекционной фотографии, так что здесь нужно только изумляться и восхищенно цокать языком.

Сочетание идеи большой художественной и исторической ценности с тем, что, собственно, выставлено и по какому случаю, создавало атмосферу некоторой пикантности. Выставка открылась к 7 ноября, 90-летию революции. В первом зале там висит иконостас из портретов вождей, в центре Ленин, вокруг — Сталин, Ворошилов, Маленков, Куйбышев и т. д. Дальше идут революционные массы — митинги, парады Красной армии, отправление отрядов на позиции, портреты военачальников и т. д. Абсурдность ситуации состоит в том, что, вероятно, точно такая же выставка могла быть открыта к 50-летию революции, к 40-летию и т. д. И на нее бы централизованно погнали солдат, пионеров, студентов и членов профсоюза. Собственно, прижизненные отпечатки и образовались в основном из того, что Оцуп подготовил выставку, которая в 1940 году объездила 49 городов СССР. То есть это агитпроп. Вряд ли кто-нибудь, кто восхищенно цокал языком на вернисаже, мог представить себе, что он сам, добровольно, пойдет 7 ноября на такую выставку и что она откроется в бывшей мастерской Зураба Церетели, месте когда-то, в позднебрежневское время, умеренно нонконформистском. Александр Галич писал про это: «Обкомы, горкомы, райкомы… / В их окнах, как бельма трахомы, давно никому не знакомы / безликие лики вождей». Нет, Александр Аркадьевич, это теперь не бельма трахомы, а винтажная фотография.

Вероятно, это много говорит о нас, но предмет выставки все же не мы, а вожди революции. Фотография — отчасти свидетельство, и что-то непосредственное, личное можно увидеть в этих лицах. Особенно тогда, когда мы сталкиваемся не с каноническим обликом вождей (Ленин с фото Оцупа потом украшал советский червонец), а с более ранними их снимками. Странен Сталин — молодой, худой, веселый, 1919 года, когда он еще выглядит как расторопный владелец придорожного заведения, где шашлык он готовит еще сам, и чуть постарше, 20-х годов, когда кажется, что у него уже нормальное, городское кафе и он только присматривает за делом и еще кушает с важными клиентами. Забавен молодой Хрущев, трепетный, как березка. Интересен Молотов — еще не лысый. Это можно продолжать, но этих непосредственных впечатлений немного. Дело в том, что Петр Оцуп, которому в момент революции было 34 года, был человеком, настроенным весьма революционно, но не в области фотографии. Профессионально он работал помощником в петербургских фотоателье и на службу революции принес весь набор приемов, сложившихся в этих заведениях.

Когда рассматриваешь его фотографии Первой конной армии, которую он сопровождал в походе на Польшу, то вдруг с удивлением обнаруживаешь каноны фотографии первой мировой войны. Вот Буденный в полный рост на фоне удаляющегося пейзажа — чуть присмотревшись, обнаруживаешь, что этот пейзаж — нарисованный задник, и есть даже тень от рамы задника на уровне сапог маршала. Это изображение помнишь чуть не с букваря, но как-то не приходит в голову, что это стандартный портрет офицера в увольнительной, который надел парадный мундир, начистил сапоги, браво налачил усы и пошел фотографироваться в ателье. Вот Буденный, Фрунзе и Ворошилов, склонившиеся над картой где-то в степи,— эта степь тот же задник, и это они картинно лежат не в поле, а в ателье, это стандартная «боевая» фотография офицера первой мировой — поза, которую издевательски обыгрывал еще Михаил Ларионов в своей «солдатской» серии рисунков и картин. Куйбышев на портрете выглядит как типичный актер-трагик из провинции с всклокоченными черными власами, перекошенным ртом и безумным взором неимоверной силы. Чувствуется, что человек по масштабу дарования может играть Гамлета, а ему который год достается роль кучера. Особенно забавно увидеть вдруг в Ленине за столом, склонившемся на одну ручку кресла и как бы выдвинувшемся вперед, к зрителю,— Ленине бесконечно хрестоматийном — типичный салонный буржуазный портрет (иконография для промышленников и финансистов), отыгранный в живописи тридцатью годами ранее (такие портреты лицом вперед с опорой на одну ручку кресла есть у Репина и Серова), а к концу 1910-х ставший штампом из фотоателье.

Ну а как им еще сниматься? Вряд ли можно представить себе фото Семена Михайловича Буденного, протирающего шашку над порубленными людьми. Куда приличнее начистить сапоги и пойти в ателье. Но здесь есть особый привкус.

Сейчас фотоателье пропали, их трудно вспомнить. В детстве они вызывали какое-то затхлое ощущение. Неумело нарисованные задники, продавленные кресла, диваны, отслоившееся зеркало, жирная пыль на стеклах… Я как-то пытаюсь представить себе, как Фрунзе, Ворошилов и Буденный приходят туда, как им ставят задник, кладут на пол простыню со складками, долженствующими потом изображать землю, как они на эту простыню ложатся, как поправляют им ноги, чтобы легли в кадре как надо, усы, ставят свет, и — внимание, замрите — они надолго замирают над картой. Думают как бы. Первая конная наступала на Запад, в Польшу, а если бы на Кавказ — поставили бы пальму в кадке.

Они же сами хотели себя так увидеть! Эта затхлая эстетика фотоателье, эти позы и задники, нехитрые приспособления для того, чтобы получить «настоящий» портрет, и были желаемой эстетикой революции. Ведь не Родченко же звали фотографировать вождей — вожди сами шли к Оцупу!

Я вот что пытаюсь сказать. У Ильи Эренбурга есть воспоминания о Нюрнбергском процессе. Его там поразила повседневная пошлость происходящего. «Я жадно разглядывал подсудимых, как будто искал разгадку происшедшей трагедии. Геринг улыбался хорошенькой стенографистке, Гесс читал книгу, Штрейхер жевал бутерброды. А в то время читали документы: убиты триста тысяч, шестьсот тысяч, шесть миллионов…»

Время от времени как-то распаляешься и начинаешь думать о революции как о высокой трагедии. Да нет — вот, посмотрите! Самое лучшее, самое высокое, что они могут сказать о себе — это пыльная пошлость фотоателье. И это высокие раритеты, подлинные вещи. И мы специально ходим в годовщину революции на них посмотреть. А как еще вспомнить погибших?

Полное секвенирование и характеристика 21 243 полноразмерных кДНК человека

Сбор и секвенирование полноразмерных кДНК

Для облегчения крупномасштабного сбора и секвенирования полноразмерных кДНК мы создали 107 библиотек кДНК человека, обогащенных полноразмерными кДНК клоны, представляющие 61 ткань, 21 первичную клеточную культуру и 16 клеточных линий. Мы использовали метод отбора, нацеленный на кэп, называемый олиго-кэпированием 8,9 , для всех библиотек селезенки, кроме одной, которая была сконструирована с использованием высокоселективного метода фракционирования по размеру для клонирования кДНК длинных мРНК 10 . В дополнительной таблице 1 онлайн показаны библиотеки кДНК, которые мы использовали. Средняя частота полноразмерных клонов кДНК в библиотеках составила 85%.

Мы случайным образом выбрали клоны кДНК из этих библиотек и подвергли их однопроходному секвенированию. Всего мы получили 5′-концевые однопроходные последовательности из 1 154 510 клонов кДНК. В некоторых случаях мы сравнивали эти последовательности с GenBank, используя поиск BLAST 11 . Мы обнаружили, что 40–60% наших последовательностей кДНК соответствовали записям RefSeq во время поиска.Остальные соответствовали только EST человека или не имели совпадений. Мы отобрали 21 243 клона кДНК из двух последних категорий и определили их полные последовательности. Для каждой из кДНК мы полностью секвенировали обе нити, в основном, используя метод обхода праймеров 12 . Судя по показателям качества последовательности, рассчитанным с использованием Phred 13 , точность данных о последовательности составила более 99,99%. Средняя длина кДНК составляла 2314 п.н. (дополнительная рис. 1 онлайн). Все данные о последовательностях были зарегистрированы в общедоступных базах данных через базу данных ДНК Японии (DDBJ).На нашем веб-сайте (http://fldb.hri.co.jp/cgi-bin/cDNA3/public/publication/index.cgi) возможен поиск кДНК по инвентарным номерам, положениям хромосом, различным ключевым словам или сходству последовательностей. Все физические клоны кДНК свободно доступны для использования в исследованиях по запросу. Запросы на физические клоны кДНК следует отправлять по адресу [email protected] или [email protected]

Сравнение коллекции FLJ с предсказанными генами

Мы использовали поиск BLAST для сравнения наших полноразмерных последовательностей кДНК последовательно с RefSeq (и другими соответствующими наборами данных, как показано на рис.1). Для 14 490 кДНК не было совпадений в RefSeq (за исключением 2313 записей RefSeq, которые были получены из коллекции FLJ), что указывает на то, что полные последовательности этих кДНК были уникальными для коллекции FLJ («FLJ-уникальные»). Остальные (6753 кДНК в 4263 кластерах) по крайней мере частично совпадали с последовательностями в RefSeq. Это перекрытие произошло потому, что многие последовательности кДНК, которые не имели совпадений во время отбора, были позже секвенированы другими исследователями в ходе этого проекта.Совпадения также включали изоформы альтернативного сплайсинга в RefSeq. Был также ряд кДНК, которые были идентичны последовательностям в RefSeq, но были выбраны из-за неточных данных о последовательности за один проход или человеческой ошибки при выборе клонов. Мы кластеризовали 14 490 FLJ-уникальных кДНК попарно, чтобы удалить избыточность, в результате чего получили 10 897 неизбыточных кДНК-кластеров («неизбыточные FLJ-уникальные»).

Рисунок 1: Блок-схема категоризации кДНК.

Каждая кДНК была классифицирована, как показано здесь.Дополнительные сведения о классификации (шаги * 1– * 3) см. в дополнительном примечании и дополнительном рисунке 6 в Интернете. Там же представлены подробные описания отсечек и подтверждающие доказательства.

Чтобы определить, какая доля из этих 10 897 неизбыточных кластеров, уникальных для FLJ, была ранее предсказана на основе последовательности генома (отношения хромосом кДНК FLJ см. в дополнительной таблице 2 онлайн), мы использовали поиск BLAST для сравнения этих кДНК с генами Ensembl ( используя версию 4.28,1; 29 076 генов), которые являются репрезентативными предсказанными генами на основе всестороннего анализа широкого спектра данных и, как ожидается, охватывают большинство генов человека 14 . Гены ансамбля, поддерживаемые RefSeq, были удалены из поиска. Среди 10 897 кластеров 2774 хотя бы частично совпадали с генами Ensembl («предсказано Ensembl»), а 8 123 — нет («предсказаны Ensembl»).

Затем мы проверили, были ли 8123 кластера, не предсказанные Ensembl, предсказаны с помощью ab initio программ предсказания генов, таких как DIGIT, FGENESH, GENSCAN и HMMGENES, поскольку критерии идентификации генов Ensembl основаны на несколько консервативном методе оценки. Как показано в таблице 1, 643 кластера, не предсказанных Ensembl, были предсказаны по крайней мере одной из этих программ (« ab initio — предсказано»). В общей сложности 3417 (31%) из 10 897 неизбыточных FLJ-уникальных кластеров соответствовали генам, предсказанным одним или несколькими вычислительными методами. Эти методов ab initio не предсказали существование оставшихся 7480 кластеров («непредсказанные»).

Таблица 1. Сравнение последовательностей 10 897 уникальных кДНК FLJ без избыточности и кДНК, предсказанных расчетным путем предсказывают только области, кодирующие белок, как гены.Чтобы проверить эту возможность, мы определили, сколько кластеров отвечает критериям длины ORF >100 кодонов и кодирующего потенциала >30 (рассчитано по стандартной методике 15 ). Мы использовали эти критерии, потому что большинство ORF, зарегистрированных в RefSeq, удовлетворяли им, тогда как ORF, случайно встречающиеся в геноме человека, редко соответствуют (дополнительные рисунки 2 и 3 онлайн). Из 7480 непрогнозированных кластеров 1999 («новое кодирование белка») соответствовали критериям. Всего было 5416 кластеров, кодирующих белок (2774 предсказанных Ensembl, 643 ab initio предсказанных и 1999 новых кластеров, кодирующих белок) среди 10897 неизбыточных уникальных кластеров FLJ («кодирование белка»).Мы не обнаружили ORF, соответствующих критериям, в оставшихся 5481 неизбыточных кластерах, уникальных для FLJ (см. Также дополнительное примечание и дополнительные рисунки 7 и 8 онлайн).

Уникальные для FLJ кластеры кДНК, не кодирующие белок

Распределение длин кДНК в 5481 кластере, которые были отнесены к категории некодирующих белок, было сходным с распределением других кластеров (см. также дополнительную рис. 4 онлайн) . Хотя некоторые из этих кДНК могут быть артефактами клонирования, недавние данные указывают на то, что неожиданно большие популяции некодирующих белок транскриптов существуют в клетках млекопитающих 16,17 .Геномное выравнивание этих кластеров ясно показало, что сплайсинг произошел для 1378 из 5481 кластеров. Этот сплайсинг можно считать явным доказательством того, что эти кДНК произошли от транскриптов. Далее мы исследовали, содержат ли эти кДНК какие-либо последовательности, подобные кодированию белка, с помощью GENSCAN, поскольку было возможно, что ORF могут быть нарушены оставшимися интронами, и поскольку GENSCAN может идентифицировать прерванные ORF в последовательностях кДНК. GENSCAN не обнаружил кодирующих экзоноподобных областей по крайней мере в 850 кластерах, что исключает возможность того, что сохранившиеся интроны нарушили ORF в этих кластерах.

Чтобы охарактеризовать 850 кластеров некодирующих транскриптов, мы провели поиск BLAST, используя нашу базу данных последовательностей за один проход (дополнительная таблица 1 онлайн), которая содержит множество последовательностей кДНК, полученных из различных тканей. В среднем поиск BLAST привел к 3,7 совпадениям последовательностей за один проход на кДНК. Многие кДНК соответствовали нескольким однопроходным последовательностям, что указывает на их низкие уровни экспрессии, а 44 кластера соответствовали >10 однопроходным последовательностям. Определив, из какой библиотеки кДНК были получены соответствующие однопроходные последовательности, мы смогли идентифицировать паттерны распределения экспрессии этих генов в тканях.Некоторые кДНК имели повсеместные паттерны экспрессии, тогда как другие имели очень тканеспецифические паттерны. Для 22 кДНК> 20% совпадающих однопроходных последовательностей были получены из конкретной библиотеки кДНК (примеры показаны на дополнительной рис. 4 онлайн).

GC содержание новых кДНК, кодирующих белок

Чтобы определить, почему 1999 новых кластеров, кодирующих белок, в наших FLJ-уникальных кДНК не были предсказаны в Ensembl или с помощью других вычислительных методов, мы сравнили GC содержание кДНК между новыми кодирующими белок и «предсказанные» (предсказанные Ensembl и ab initio — предсказанные) кластеры.Содержание GC мРНК RefSeq колебалось в широком диапазоне от 30% до 70% с двумя пиками, один на ~42%, а другой на ~58% (рис. 2а). Содержание GC предсказанных и новых кДНК, кодирующих белок, показало аналогичные широкие распределения, но только с одним пиком в каждом: 42% для предсказанных и 58% для непредсказанных кДНК. Это говорит о том, что в современных процедурах предсказания генов существует некоторая предвзятость предсказания относительно транскриптов, богатых GC. Это видно и по распределению GC-содержания генов Ensembl. В отличие от мРНК RefSeq, пик около 58% для всех генов Ensembl менее выражен.

Рис. 2: GC-содержание кДНК FLJ и соответствующих геномных областей, с которыми они были картированы.

( a ) Показано содержание GC новых кДНК, кодирующих белок, кДНК, не кодирующих белок, транскриптов RefSeqs и Ensembl. ( b ) Содержание GC геномных областей, в которые были картированы соответствующие транскрипты (от 5′-концов первых экзонов до 3′-концов последних экзонов), показано для каждой категории транскриптов. Подробный протокол хромосомных назначений кДНК FLJ см. в дополнительном примечании онлайн (раздел о распределении длин и хромосомных распределениях раздела 10 897 неизбыточных уникальных кластеров FLJ).Хромосомные положения генов RefSeqs и Ensembl представлены в браузере генома Калифорнийского университета в Санта-Круз.

Поскольку интроны, как правило, более богаты AT, чем экзоны 4 , распределение содержания GC в соответствующих геномных областях как для новых белок-кодирующих, так и для предсказанных кДНК сместилось в сторону большего количества AT. Но общие закономерности показали сходные тенденции с кДНК (рис. 2b). Таким образом, современные процедуры предсказания генов могут иметь небольшую предвзятость по отношению к предсказанию генов в областях, богатых GC.Это противоречит предыдущим наблюдениям о том, что точность этих методов предсказания генов нечувствительна к содержанию GC (или лучше в регионах, богатых GC) 18,19 . Расхождение, вероятно, вызвано тем фактом, что предыдущие анализы были основаны на меньшем наборе данных и не могут быть точно экстраполированы на масштаб полного генома.

Мы также рассчитали распределение содержания GC некодирующих и предполагаемых некодирующих кДНК (рис. 2). К нашему удивлению, оба типа кДНК были относительно AT-богаты (рис. 2а). Новые белок-кодирующие и предполагаемые некодирующие кДНК первоначально были сгруппированы вместе как «непредсказанные», а затем разделены в соответствии с критериями длины ORF >100 кодонов и кодирующего потенциала >30 (рис. 1). Таким образом, мы ожидали, что эти две категории могут иметь одинаковое распределение контента GC. Вместо этого распределения содержания GC как предполагаемых некодирующих, так и некодирующих кДНК имели пик около 42%, аналогичный пику предсказанных клонов, но диапазон был намного более узким. Содержание GC в геномных областях, где были картированы эти кДНК, показало аналогичную тенденцию к обогащению АТ (рис.2б). Это повысило вероятность того, что некодирующие кДНК и новые кДНК, кодирующие белок, в основном транскрибируются из разных областей генома человека.

Аннотация кодирующих белок уникальных кДНК FLJ

Для 5416 кодирующих белок кластеров мы определили их аминокислотные последовательности из соответствующих последовательностей кДНК. Из 1999 новых кДНК, кодирующих белок, мы удалили кДНК, которые, по-видимому, произошли от возможно укороченных или незрелых форм мРНК (T. Nishikawa et al ., неопубликованные данные; см. также дополнительное примечание онлайн), осталось 1872 кДНК («полностью новое кодирование белка»). Таким образом, дальнейшему анализу подверглись 5289 кластеров. Средняя длина ORF составляла 335 кодонов (см. Дополнительный рисунок 1 онлайн для распределения длины ORF).

Используя аминокислотные последовательности, мы провели поиск в базах данных белковых мотивов PROSITE (версия 16) и Pfam (версия 5.5). При поиске PROSITE мы обнаружили, что 1318 (25%) этих кДНК имели некоторую сигнатуру белка (таблица 2).При поиске Pfam мы обнаружили, что 3112 (59%) кДНК имели некоторый мотив(ы) Pfam. Всего было представлено 1529 видов мотивов Pfam, что соответствует 63% от общего числа 2478 мотивов Pfam. Мы также искали предполагаемые мембранные белки и секреторные белки, используя SOSui и PSORT II, ​​соответственно (таблица 3), которые предсказали 244 кДНК для секреторных белков и 848 кДНК для мембранных белков. Подробные функциональные аннотации для каждой из этих кДНК доступны на наших веб-сайтах 20,21 .

Таблица 2 Функциональная классификация и распределение белковых мотивов 5289 кластеров, кодирующих белок Таблица 3 Прогнозируемые секреторные белки и мембранные белки транскрипты, кодирующие белок, к хромосомам 20, 21 и 22 соответственно (дополнительная таблица 2 онлайн). Эти хромосомы являются «законченными» хромосомами, первоначальные аннотации которых считаются завершенными.Как показано в таблице 4, 491 из 10 897 неизбыточных FLJ-уникальных кластеров картированы на этих хромосомах. Из этих 491 268 были кДНК, кодирующими белок, включая 100 полных новых кДНК, кодирующих белок. Было 2188 ранее предсказанных генов (гены Ensembl и ab initio — предсказанных генов). Из них 1004 экспериментально идентифицированных кДНК, зарегистрированных в RefSeq; таким образом, наши анализы кДНК FLJ подтвердили наличие 168 (14%) из 1184 генов, которые были предсказаны без поддержки полноразмерной кДНК, а также идентифицировали дополнительные 100 генов, кодирующих белок. Этот результат подчеркивает, что данные полноразмерной кДНК должны способствовать точной аннотации генома человека.

Таблица 4 кДНК FLJ, картированные на хромосомах 20, 21 и 22

Из этих 100 полных новых кластеров, кодирующих белок, мы экспериментально подтвердили экспрессию 84 (84%) с помощью ОТ-ПЦР с использованием восьми видов тканей человека (дополнительный рис. 5 онлайн). Для других кДНК мы не наблюдали четкой полосы в наших экспериментальных условиях, возможно, потому, что уровни их экспрессии были слишком низкими или их экспрессия была высокоспецифичной для тканей или операционного материала, из которых мы выделили РНК для создания библиотек кДНК.

Мы также попытались провести ОТ-ПЦР-анализ некодирующих транскриптов, картированных на хромосомах 20–22. Мы обнаружили полосы ПЦР для 32 из этих кластеров (74%) и наблюдали как повсеместные, так и тканеспецифические паттерны экспрессии (дополнительная рис. 5 онлайн). По-видимому, в геноме человека существуют по крайней мере сотни потенциальных транскриптов, не кодирующих белок, некоторые из которых экспрессируются повсеместно, а другие тканеспецифично.

Полноразмерные вставки L1 человека сохраняют способность к высокочастотной ретротранспозиции в культивируемых клетках | Молекулярная генетика человека

Аннотация

Функциональные элементы L1 представляют собой автономные ретротранспозоны, которые могут встраиваться в гены человека и вызывать заболевания.На сегодняшний день было обнаружено, что 10 из 12 известных ретротранспозиций L1 в гены человека являются 5′-усеченными и неспособными к дальнейшей ретротранспозиции. Здесь мы сообщаем нуклеотидные последовательности двух полноразмерных элементов L1, L1 β-thal и L1 RP , которые вставлены в гены β-глобина и пигментного ретинита-2 (RP2) соответственно. L1 β-thal на 99,4% идентичен консенсусной последовательности активных L1 человека, тогда как L1 RP идентичен на 99,9%. Оба элемента сохраняют впечатляющую способность к высокочастотной ретротранспозиции в культивируемых клетках HeLa. Действительно, L1 RP является наиболее активным L1, выделенным на сегодняшний день. Наши данные показывают, что не все вставки L1 в гены человека «мертвы по прибытии». Наши результаты также подтверждают концепцию предпочтения цис , согласно которой белки, кодируемые конкретным L1, преимущественно действуют на кодирующую их РНК, в отличие от других L1 РНК.

Введение

элемента LINE-1 или L1 представляют собой автономные не-LTR ретротранспозоны, которые могут быть транскрибированы в РНК, обратно транскрибированы в кДНК и интегрированы в новые геномные участки.Элементы L1 человека состоят из 5′-UTR с внутренним промотором (1), двух открытых рамок считывания (ORF1 и ORF2), 3′-UTR и поли(А)-хвоста (2). ORF1 кодирует белок, связывающий нуклеиновую кислоту (3,4), а ORF2 кодирует белок с эндонуклеазной активностью (5), активностью обратной транскриптазы (6) и мотивом, богатым цистеином на С-конце (7). В геноме человека насчитывается около 100 000 элементов L1 (8), но считается, что только около 30–60 способны к ретротранспозиции (9). Более 95% всех человеческих L1 укорочены с 5′-конца, в то время как другие содержат кодоны терминации, сдвиги рамки считывания или другие вредные мутации, которые устраняют активность.На сегодняшний день 12 ретротранспозиций L1 в гены были зарегистрированы как болезнетворные мутации (10–18; E. Bakker and G. van Ommen, личное сообщение). Одиннадцать из 12 вставок принадлежат подмножеству Ta (19; C. Meischl, личное сообщение), группе транскрипционно активных L1, которая содержит большинство ретротранспозиционно-компетентных элементов. Из 12 вставок 10 были 5′-укороченными и, следовательно, неспособными к последующей ретротранспозиции. Здесь мы демонстрируем, что две полноразмерные вставки L1 являются высокоактивными в анализе ретротранспозиции на основе клеточной культуры и, вероятно, способны к вторичной ретротранспозиции in vivo .

Результаты и обсуждение

L1 β-thal был обнаружен у матери и дочери украинского происхождения с гематологическими показателями, типичными для β-талассемии (15). L1 был встроен в 3′-конец интрона 2 гена β-глобина в антисмысловой ориентации. Он имеет две ORF, поли(А)-хвост длиной 107 п.н. и фланкирован дупликацией сайта-мишени размером 9–13 п.н. L1 β-thal на 99,4% идентичен консенсусной последовательности активных L1 человека, а его кодируемые белки содержат 11 аминокислотных отличий от консенсуса (рис.1). L1 RP был обнаружен в интроне 1 гена пигментного ретинита-2 (RP2) пациента с Х-сцепленным пигментным ретинитом и его матери-носителя (17). L1 RP имеет две ORF, необычный поли(А)-хвост, в котором А-тракт прерывается 11 нуклеотидами (GTTTTAAATTT) и окружен дупликацией сайта-мишени из 14 п.н. Последовательность L1 RP на 99,9% идентична активной консенсусной последовательности L1, а кодируемые ею белки содержат только три аминокислотные замены от консенсуса (рис. 1).

Чтобы определить, сохранили ли вставки L1 β-thal и L1 RP способность к ретротранспозиции, мы протестировали их в анализе культивируемых клеток, который показал обнаружение аутентичных событий ретротранспозиции (20). Для этого анализа мы клонировали элементы в эписомальный вектор экспрессии, так что индикаторная кассета mneo1 присутствовала в их 3′-UTR в антисмысловой ориентации. Эта кассета может быть активирована при ретротранспозиции, чтобы придать устойчивость к G418 трансфицированным клеткам (20).Для каждого L1 мы тестировали три разные конструкции (таблица 1), одна из которых содержала как гетерологичный промотор непосредственно раннего CMV (pCMV) 5′ к L1, так и сигнал полиаденилирования SV40 [SV40 poly(A)] 3′ к L1, второй, содержащий только поли(А) SV40, и третий, не содержащий ни pCMV, ни поли(А) сигнала SV40 (нативный L1). Как предсказывает их высокая степень сходства с согласованной последовательностью активных элементов, как L1 β-thal , так и L1 RP ретротранспонируются с частотами, сравнимыми с теми, которые сообщаются для L1.3 (9), ранее наиболее активный элемент в этом анализе. В самом деле, L1 RP конструирует ретротранспозицию с частотой вдвое большей, чем L1. 3, что делает L1 RP наиболее активным человеческим L1, выделенным на сегодняшний день. Удаление либо pCMV, либо поли(A) pCMV и SV40 увеличивало наблюдаемые частоты ретротранспозиций L1.3 и L1 RP . Возможные объяснения этого увеличения включают потерю конкуренции между соседними промоторами за полимеразу и факторы транскрипции или устранение стерических затруднений в сайтах связывания полимеразы.Эти результаты обеспечивают дополнительное доказательство того, что элементы L1 ретротранспонируют очень эффективно в этом анализе (21).

Рисунок 1

L1 β-thal и L1 RP тесно связаны с консенсусной последовательностью активных элементов L1. Эта консенсусная последовательность была получена путем сравнения последовательностей семи полноразмерных элементов (L1.2A, LRE2.1, L1.3, L1.4, L1.19, L1.20 и L1.39), способных к ретротранспозиции в культивируемом клеточный анализ (25). Приблизительное расположение доменов эндонуклеазы и обратной транскриптазы указано EN и RT, а полноразмерные L1 равны 6. 0 кб.

Рисунок 1

L1 β-thal и L1 RP тесно связаны с согласованной последовательностью активных элементов L1. Эта консенсусная последовательность была получена путем сравнения последовательностей семи полноразмерных элементов (L1.2A, LRE2.1, L1.3, L1.4, L1.19, L1.20 и L1.39), способных к ретротранспозиции в культивируемом клеточный анализ (25). Приблизительное расположение доменов эндонуклеазы и обратной транскриптазы указано EN и RT, а полноразмерные L1 равны 6.0 кб.

Данные семи укороченных вставок человека ранее показали, что вновь вставленные L1s, вероятно, возникают из активных полноразмерных элементов-предшественников (12,22). Области, кодирующие белок, в этих ранее охарактеризованных вставках были интактными, но усеченными, указывая на то, что эти элементы могли бы сохранять активность, если бы они не были усечены в какой-то момент во время ретротранспозиции. Кроме того, две недавно ретротранспонированные полноразмерные вставки мышиного L1 сохраняли ретротранспозиционную активность в культивируемых клетках и, вероятно, способны к вторичной ретротранспозиции в мышином геноме (23). L1 β-thal и L1 RP являются первыми недавно ретротранспонированными полноразмерными вставками L1 человека, доступными для дальнейшей характеристики. То, что они сохранили ретротранспозиционную активность в этом анализе, дает первое свидетельство того, что некоторые болезнетворные вставки L1 человека не инактивируются при ретротранспозиции. Следует отметить, что активность в анализе культивируемых клеток не доказывает, что эти элементы будут снова ретротранспозировать из своих новых геномных местоположений. Другие факторы, такие как репрессивные эффекты структуры хроматина и метилирования, могут играть роль в поддержании ретротранспозиции под контролем (24).

Было высказано предположение, что белковые продукты конкретного L1 связываются в первую очередь с кодирующей их РНК, т.е. предпочтительно цис (22). Хотя подавляющее большинство L1 неактивны, нет охарактеризованных болезнетворных вставок L1, содержащих нонсенс или мутации сдвига рамки считывания. Кроме того, две полноразмерные вставки L1 мыши и предшественники двух усеченных вставок L1 человека были ретротранспозиционно активными элементами (20, 23). Кроме того, L1, мутированный либо в ORF1, либо в ORF2, не может быть эффективно дополнен котрансфекцией с активным L1 в анализе культивируемых клеток (J.В. Моран и Х.Х. Казазян, неопубликованные данные). Наблюдение, что L1 β-thal и L1 RP являются высококомпетентными к ретротранспозиции, дополнительно подтверждает доводы в пользу предпочтения цис при ретротранспозиции L1.

Материалы и методы

Выделение и секвенирование L1

β-thal и L1 RP

Используя последовательность, полученную из субклонированных фрагментов точки разрыва (15), мы амплифицировали полноразмерный L1 из гена β-глобина с использованием системы ПЦР Expand Long Template (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) и праймеров, фланкирующих вставленный L1 (GlobinL1-5 ‘, 5′-CCCAACCATAAAATAAAAGCAGAGAGG-3′; GlobinL1-3′, 5′-GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAA-3’). Условия ПЦР: один цикл 94°С в течение 1 мин; 10 циклов: 94°С в течение 10 с, 63°С в течение 30 с и 68°С в течение 4 мин; 20 циклов: 94°С в течение 10 с, 63°С в течение 30 с, 68°С в течение 4 мин + 20 с автоэлонгация/цикл; один цикл 68°С в течение 7 мин. Реакции содержали 2,6 ед смеси ферментов Expand Long Template, 350 мкМ каждого dNTP и 300 мкМ каждого ДНК-праймера в буфере Expand PCR 1. Поскольку GlobinL1-5′ содержит 5 нуклеотидов 5′-последовательности L1 на 3′-конце, эта пара праймеров специально амплифицировали только аллель β-глобина, содержащую вставку L1.Мы очистили продукт ПЦР размером 6 т.п.н., используя систему очистки для подготовки к ПЦР Wizard (Promega, Мэдисон, Висконсин), и клонировали его в сценарий pPCR (Stratagene, La Jolla, CA) в соответствии с протоколом производителя. Мы объединили три клона в эквимолярном соотношении и секвенировали их, используя секвенаторы растяжения ABI 377 или 373A с химией Taq FS Dye Terminator, чтобы создать последовательности для этого элемента. Мы секвенировали pPCR.L1Glo-62, клон ПЦР, используемый для создания клонов на основе CEP4 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), протестированных в анализе ретротранспозиции (20), отдельно для скрининга ошибок ПЦР.Используя этот метод, мы определили две ошибки: одну в 5′-UTR в нуклеотиде 309 и синонимичное изменение в кодоне 651 ORF2. Поскольку в pPCR.L1Glo-62 не было изменено ни одной аминокислоты, ошибки не были исправлены до выполнения дополнительных стадий клонирования.

Мы клонировали L1 RP таким же образом, как L1 β-thal , используя опубликованную фланкирующую последовательность и геномную ДНК (17). Для этой амплификации использовали следующие праймеры: RP2L1-5′, 5′-TGGAATGTGTATTAAGACTGTAAGGTGGG-3′; RP2L1-3′, 5′-ACTGCCTGGTTTATGCCGCTTA-3′.Условия ПЦР были аналогичны тем, которые использовались для амплификации L1 β-thal , но температура отжига составляла 68°C, а не 63°C. Мы создали последовательность для этого элемента путем секвенирования четырех клонов, объединенных в эквимолярном соотношении. Как и в случае L1 β-thal , мы отдельно секвенировали клон L1 RP , предназначенный для использования на дальнейших стадиях клонирования, pPCR.L1RP-32. В pPCR.L1RP-32 было семь ошибок, одна в 5′-UTR в нуклеотиде 342, одна в области между ORF в нуклеотиде 1952 и пять в ORF2 (кодоны 192, 210, 236, 294 и 1168).Только одна из ошибок ПЦР в ORF2 привела к замене аминокислоты (I1168T). Хотя считается, что остаток 1168 не находится в функциональном домене, мы исправили эту ошибку, заменив фрагмент Spe I- BstZ 17I в pPCR.L1RP-32 таким же фрагментом из другого клона L1 RP с правильным последовательность для создания pPCR.L1RPS-5. Затем мы использовали pPCR.L1RPS-5 для создания векторов на основе pCEP4 для анализа ретротранспозиции. Номера доступа Genbank для L1 β-thal и L1 RP : AF149422 и AF148856 соответственно.

Создание конструкций для анализа ретротранспозиции

Исходная ретротранспозиционная конструкция JM101 (20) состоит из pCEP4 (Invitrogen), L1. 2 и кассеты mneoI в 3′-UTR L1.2. Большинство элементов L1 содержат сайт BstZ 17I в их 3′-UTR рядом с 3′-концом элемента, в то время как сайт Not I присутствует в клонирующем векторе между промотором CMV и 5′-UTR элемента. L1. Для создания PJM101 / L1 β-Thal и его ΔCMV и ΔCMV ΔSV40 производных поли (а) + , мы перевариваем PJM101, PJM101ΔCMV и PJM101ΔCMV ΔSV40 Poly (A) + с не I и BST Z17i удалить L1.2 (20). Затем мы удалили L1 β-thal из pPCR.L1Glo-62 в виде фрагмента 6,0 kb Not I- Bst Z17I и лигировали его в различные скелеты pJM101. Мы создали pJM101/L1 RP и его производные ΔCMV и ΔCMV ΔSV40 poly(A) + таким же образом, используя фрагмент Not I- Bst Z17I размером 6,0 т.п.н. из pPCR.L1RPS-5. Анализ ретротранспозиции проводили, как описано ранее (20).

Благодарности

Мы благодарим Джона Гудье, Эрика Остертага и Элин Лунинг Прак за полезные обсуждения, а также центр секвенирования ДНК Школы медицины Университета Пенсильвании за секвенирование ДНК. Эта работа была поддержана грантом от NIH.

Каталожные номера

1.

Идентификация, характеристика и клеточная специфичность промотора LINE-1 человека

,

Mol. Клетка. биол.

,

1990

, том.

10

 (стр. 

6718

6729

)2,  .

Влияние ретротранспозонов L1 на геном человека

Nature Genet.

,

1998

, том.

19

 (стр. 

19

24

)3,  .

Секвен-специфичный одноцепочечный РНК-связывающий белок, кодируемый ретротранспозоном LINE-1 человека

,

EMBO J.

,

1997

, vol.

16

 (стр. 

6034

6043

)4,  .

In vitro свойства первого белка ORF мыши LINE-1 подтверждают его роль в образовании рибонуклеопротеиновых частиц во время ретротранспозиции

,

Proc. Натл акад. науч. США

,

1997

, том.

94

 (стр. 

10155

10160

)5,  ,  ,  .

Ретротранспозон L1 человека кодирует консервативную эндонуклеазу, необходимую для ретротранспозиции.

87

 (стр. 

905

916

)6,  ,  ,  ,  .

Обратная транскриптаза, кодируемая мобильным элементом человека

,

Science

,

1991

, vol.

254

 (стр. 

1808

1810

)7,  .

Последовательности ДНК LINE-1 в четырех отрядах млекопитающих предсказывают белки, которые сохраняют гомологию с белками ретровирусов

,

Nucleic Acids Res.

,

1987

, том.

15

 (стр. 

2251

2260

)8,  ,  ,  ,  . , .

Линии и связанные с ними ретримозоны: Длинные межсекретные последовательности в эукариотическом геноме

,

Mobile DNA

,

1989

Вашингтон, DC

ASM Press

(стр.

593

617

) 9,,,,,,,,,, ,  ,  .

Многие элементы L1 человека способны к ретротранспозиции

,

Nature Genet.

,

1997

, том.

16

 (стр. 

37

43

)10,  ,  ,  ,  ,  .

Гемофилия А, возникающая в результате de novo вставки последовательностей L1, представляет собой новый механизм мутации у человека

,

Nature

,

1988

, vol.

332

 (стр. 

164

166

)11,  ,  ,  ,  ,  .

Характеристика неповрежденной вставки L1 в интрон гена фактора VIII человека и дополнительные доказательства наличия открытых рамок считывания в функциональных элементах L1

4

 (стр. 

290

296

)12,  ,  ,  ,  .

Новый ретротранспозируемый элемент L1 человека из локуса LRE2 на хромосоме 1q дает химерную вставку

,

Nature Genet.

,

1994

, том.

7

 (стр. 

143

148

)13,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Вставка 5′-усеченного элемента L1 в 3′-конец экзона 44 гена дистрофина привела к пропуску экзона во время сплайсинга в случае мышечной дистрофии Дюшенна

,

J.клин. Вкладывать деньги.

,

1993

, том.

91

 (стр. 

1862

1867

)14,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Нарушение гена APC ретротранспозной вставкой последовательности L1 при раке толстой кишки

,

Cancer Res.

,

1992

, том.

52

 (стр.  

643

645

)15,  ,  ,  ,  ,  .

Новый механизм b-талассемии. Вставка ретромобильного элемента L1 в β-глобин IVSII

,

Blood

,

1996

, vol.

88

стр.

148a

 16,  ,  ,  ,  .

Инсерционная мутация мобильным элементом L1 в гене DMD приводит к Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатии

,

Hum. Мол. Жене.

,

1998

, том.

7

 (стр. 

1129

1132

)17,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Позиционное клонирование гена Х-сцепленного пигментного ретинита 2

,

Nature Genet.

,

1998

, том.

19

 (стр.

327

332

)18,  ,  .

Хроническая гранулематозная болезнь, вызванная ретротранспозонами линии 1

,

Eur. Дж. Гематол.

,

1998

, том.

60

 (стр. 

349

350

)19,  ,  .

Транскрипты линии 1 единичной длины в клетках тератокарциномы человека

,

Mol. Клетка. биол.

,

1988

, том.

8

 (стр.  

1385

1397

)20,  ,  ,  ,  ,  .

Высокочастотная ретротранспозиция в культивируемых клетках млекопитающих

,

Клетка

,

1996

, vol.

87

 (стр. 

917

927

)21,  ,  .

Перетасовка экзонов путем ретротранспозиции L1

,

Science

,

1999

, vol.

283

 (стр. 

1530

1534

)22,  ,  ,  ,  .

Изоляция активного мобильного элемента человека

,

Наука

,

1991

, том.

254

 (стр. 

1805

1808

)23,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

Активно ретротранспонирующее, новое подсемейство мышиных элементов L1

,

EMBO J.

,

1998

, том.

17

 (стр. 

590

597

)24,  ,  .

Метилирование цитозина и экология внутригеномных паразитов

,

Trends Genet.

,

1997

, том.

13

 (стр. 

335

340

)25. , 

Характеристика пяти новых элементов L1 человека, способных к ретротранспозиции

1996

Балтимор, Мэриленд

Университет Джонса Хопкинса

© 1999 Издательство Оксфордского университета

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Систематический подход к тестированию экспрессии полноразмерных белков человека в бесклеточных системах экспрессии | BMC Biotechnology

С помощью этого подхода мы оценили эффективность трех различных систем экспрессии белков in vivo и in vitro с набором из 960 полноразмерных открытых рамок считывания. Для наших исследований синтеза белка мы выбрали бактерий Escherichia coli , так как это одна из наиболее распространенных и простых в использовании систем. Для бесклеточной экспрессии in vitro мы сравнили E. coli с протоколом зародышей пшеницы.

Сначала мы проанализировали уровень экспрессии белка в двух системах E. coli ( in vitro и in vivo ) и обнаружили, что экспрессия выше в системе in vivo (66% по сравнению с 48%). ).Что касается успеха обоих протоколов, только 22% плазмид не дали белка.

Затем мы сосредоточились на подмножестве из 87 мишеней, которые не дали белка в E. coli in vivo . Эти мишени, экспрессированные с помощью протокола бесклеточных зародышей пшеницы и E. coli , давали очень разные скорости экспрессии белка. В зародышах пшеницы было экспрессировано 86% мишеней, а в бесклеточной E. coli только 43%. Одна из причин неудачной экспрессии белка in vitro у E.coli может заключаться в наличии вторичных структур в мРНК, которые могут ингибировать трансляцию [19]. Для решения этой проблемы мы использовали программное обеспечение ProteoExpert, которое предсказывает возможные проблемы, связанные с последовательностями, и предлагает оптимизированные последовательности с потенциально уменьшенными неблагоприятными вторичными структурами [18, 20]. Из 87 белков, которые не экспрессировались в E. coli in vivo , 37 экспрессировались in vitro с использованием последовательности дикого типа. Другой набор из 37 белков человека может быть восстановлен путем оптимизации последовательности и использования линейных матриц для экспрессии in vitro .Таким образом, общий уровень успеха in vivo отрицательных клонов составил 85%. Этот результат ясно демонстрирует, что оптимизация последовательности необходима для улучшения синтеза белка в системе E. coli in vitro.

Кроме того, мы проанализировали влияние положения метки на скорость экспрессии белка. Мы не обнаружили различий между C- или N-концевыми метками в системе зародышей пшеницы. Однако, учитывая бесклеточную систему E. coli , 60% успешной экспрессии было получено с N-концевым продуктом ПЦР дикого типа, в отличие от только 34% с С-концевым продуктом.В этом контексте важно понимать, что эти 60% экспрессии с N-концевой меткой совпадают с 59%, полученными с C-концевым мутантом. Очевидно, что модификация последовательности путем добавления пептидной метки с оптимизированной последовательностью также позволяет избежать проблем с экспрессией, связанных с инициацией трансляции.

После анализа 87 оптимизированных экспрессий in vitro осталось 6 образцов, которые не экспрессировались in vivo или in vitro (Таблица 2). Это соответствует коэффициенту успеха экспрессии белка 93%.Что касается тех белков, которые не могут быть экспрессированы ни в одной из систем, поразительно, что молекулярная масса всех этих мишеней превышает 63 кДа при средней молекулярной массе 91 кДа. К неудачным мишеням относятся два связанных с мембраной белка: PNPLA8 (89 кДа) и SLC40A1 (63 кДа), последний с более чем 10 трансмембранными доменами. Кроме того, ДНК-связывающий белок KIF22 (74 кДа) семейства кинезинов, участвующий в формировании веретена, ELAC2 (93 кДа) эндонуклеаза, TTLL5 (92 кДа), белок, подобный тубулинтирозинлигазе, и KIAA1287 (135 кДа), гипотетический белок с одним трансмембранным доменом относятся к числу неэкспрессирующихся мишеней.На данный момент неясно, функционально ли эти человеческие белки экспрессируются в какой-либо из систем. Следовательно, мы не можем строить догадки о взаимных помехах между функцией белка и различными системами экспрессии.

Однако 6 белков со средней молекулярной массой 72 кДа экспрессировались в E. coli in vitro , но не в зародышах пшеницы. Среди этих белков есть HMOX2, принадлежащий к семейству гемоксигеназ, железосодержащий белок с одним трансмембранным доменом.Как сообщалось недавно, железосодержащие белки требуют дополнительных источников железа, которые в данном случае не добавлялись [21]. Далее два белка с трансмембранными доменами (MLSTD1 с двумя трансмембранными доменами и TLR1 с одним). Каждый из трех белков RACGAP1, FLJ20203 и HSPC049 содержит по одному спиральному спиральному домену и имеет молекулярную массу выше 70 кДа. Очевидно, экспрессия белков с молекулярной массой выше 70 кДа является критической для системы зародышей пшеницы [22].

Остаются также десять белков со средней молекулярной массой 45 кДа, которые экспрессировались в зародышах пшеницы, но не в E.coli in vitro . Объяснение этому нельзя найти в структурных доменах, поскольку спиральный клубок и один трансмембранный домен не препятствовали экспрессии упомянутых выше белков. Кроме того, молекулярная масса не является проблемой. Что касается функции этих белков, то SUPT7L (фактор регуляции транскрипции), EIF2S2 (фактор инициации трансляции) и RPL23A (белок, связывающий рРНК) представляют собой белки, которые взаимодействуют с ДНК или РНК. Похоже, что эти белки могут оказывать негативное влияние на их рекомбинантную экспрессию, когда они функционально активны в E.coli клеток. Также белки, влияющие на клеточный цикл, такие как DAP (участвующий в гибели клеток), KIAA1142 (имеет киназный мотив), PAK4 (киназа, участвующая в пути JNK), GPSM2 (сигнальный модулятор) и OS-9 (влияет на жизнеспособность клеточного роста). препятствуют экспрессии рекомбинантных белков.

На основании анализа вестерн-блоттинга выход белка в зародышах пшеницы был выше по сравнению с экспрессией в E. coli in vitro . Это может быть связано с тем, что in vitro E.coli представляет собой периодический метод экспрессии белка, тогда как система зародышей пшеницы основана на двухкомпонентной системе. Две камеры разделены полупроницаемой мембраной, которая концентрирует экспрессированный белок в реакционной камере объемом 50 мкл, но пропускает соединения, необходимые для синтеза белка, такие как субстраты и энергетические компоненты, в большую питающую камеру. В то же время потенциально ингибирующие побочные продукты разбавляются за счет диффузии через мембрану.Система зародышей пшеницы показала самый высокий уровень успеха по сравнению с экспрессией в E. coli in vitro или in vivo . Таким образом, для экспрессии белка in vitro , особенно для токсичных белков, которые не могут быть экспрессированы в бактериях, методом выбора является система зародышей пшеницы.

Сравнивая растворимость белка в бактериях E. coli и бесклеточных системах E. coli и зародышах пшеницы, мы обнаружили, что система зародышей пшеницы обеспечивает самую высокую степень растворимости (97%).Об этом также сообщалось ранее [22]. Следует отметить, что наша экспериментальная методика не исключает образования белковых агрегатов. Кроме того, данные показывают, что белки, экспрессированные in vitro , более вероятно, будут растворимыми, чем белки, экспрессированные in vivo . Однако даже несмотря на то, что экспрессия E. coli in vivo показала при первом подходе более высокую степень успеха, чем in vitro , система in vitro действительно имеет преимущества.Экспрессия белка происходит очень быстро и может быть осуществлена ​​в течение нескольких часов. Экспрессия продуктов токсического гена позволяет экспрессировать белки, которые невозможно экспрессировать в бактериях. Также возможно использование продуктов ПЦР, и для экспрессии белка не требуются клоны. Однако линейная ДНК должна быть защищена во время реакций in vitro для подавления активности нуклеазы. Кроме того, белки также с большей вероятностью будут растворимы при экспрессии в любой из систем in vitro , используемых по сравнению с экспрессией в бактериях.

Таким образом, мы продемонстрировали, что бесклеточная экспрессия белка приводит к желаемому полноразмерному белку с общим уровнем успеха до 93%. В нашем исследовании экспрессия зародышей пшеницы с использованием двухкамерной системы является предпочтительным методом, поскольку он демонстрирует высокую растворимость и высокий выход белка.

Проект секвенирования полноразмерной кДНК человека | Центр биологических ресурсов, NITE (NBRC)

日本語で表示

Мы, Национальный институт технологии и оценки (NITE), секвенировали 5′-концевые последовательности примерно 920 000 клонов в рамках проекта NEDO «Проект секвенирования полноразмерной кДНК человека», целью которого является анализ новых кДНК человека с апреля по сентябрь 2001 года.
NITE выполнила реакции последовательности, секвенирование, проверку точности данных и отправила данные в Helix Research Institute Co.Ltd (HRI). Секвенированные клоны выбирают из полной библиотеки кДНК человека Института медицинских наук Токийского университета и HRI лабораторией Hitachi Kimitsu, и эти клоны секвенируют после проверки в HRI.
Более того, после анализа данных в HRI, полноразмерные последовательности новых кДНК человека были определены в Otsuka Pharmaceutical Co.Ltd., Fujiya Co. Ltd., Hitachi Co.Ltd., Hitachi Science Systems Co.Ltd., Takara Shuzo Co.Ltd., Toyobo Co.Ltd. и Nisshinbo Industries Co.Ltd.

Связаться с нами

Отдел промышленных инноваций, Центр биологических ресурсов, Национальный институт технологий и оценки

Адрес: 2-49-10 Nishihara, Shibuya-ku, Tokyo, 151-0066 JAPAN MAP
Контактная форма

Эффективное и масштабируемое производство полноразмерных вариантов гентингтина человека в клетках млекопитающих с использованием системы транзиентной экспрессии

Вектор транзиентной экспрессии (pcDNA3. 1-Q23- HTT -TEV-FLAG, Рисунок 1A ) разработан для быстрого производства в клетках млекопитающих FL Q23-HTT (аминокислоты 1-3144, на основе нумерации Q23). Эта конструкция имеет функции, предназначенные для быстрого создания различных конструкций мутаций HTT путем клонирования кассеты, облегчения очистки белка HTT до высокого качества и гомогенности с минимальными хроматографическими этапами, а также возможность получения немеченого FL HTT. Список признаков включает: 1. Сайты рестрикционного расщепления HindIII, окружающие повтор CAG в экзоне 1 HTT, могут быть использованы для получения мутантов FL HTT с полиQ-участком различной длины путем расщепления и лигирования рестрикционными ферментами; 2.С-конец FL HTT помечен FLAG-эпитопом с сайтом узнавания протеазой TEV для одноэтапной аффинной очистки FL HTT с высокой степенью чистоты и необязательной генерации белка FL HTT без метки с использованием расщепления протеазой TEV; 3. Оптимизированная по кодонам последовательность FL HTT для использования кодонов клеток человека для экспрессии высокого уровня в клетках HEK293. Вектор pcDNA 3.1 (+) используется в качестве основы конструкции, чтобы воспользоваться преимуществами высокой активности активации транскрипции промотора CMV в клеточных линиях млекопитающих.

Используя pcDNA3.1-Q23- HTT -TEV-FLAG в качестве исходной матрицы, конструкции Q48 и Q73 FL HTT были получены путем синтеза фрагментов ДНК с надлежащей длиной Q, охватывающих два сайта рестрикции HindIII, и замены той же области в шаблон. Мутант ΔExon1 FL HTT (а.о. 91-3,144) ( Фигура 1B ) был получен с использованием праймеров, направленных на делетированные остатки, охватывающие область экзона 1 в матрице. Клетки HEK293, трансфицированные pcDNA3.1-Q23- HTT -TEV-FLAG с использованием PEI, выращивали в колбах на 5 л при 5% CO 2 .Типичная крупномасштабная очистка использует осадок клеток объемом 2–10 л, содержащий 6,0 × 10 9 -3,0 × 10 10 клеток. Прежде чем приступить к очистке, уровень экспрессии HTT от каждой трансфекции оценивали с помощью количественного вестерн-блоттинга с использованием очищенного рекомбинантного HTT с меткой FLAG в качестве стандарта и антитела против FLAG в качестве первого антитела. Осадки с предполагаемым уровнем экспрессии HTT ≥2 пг HTT/клетку использовали для очистки.

Очистка FL HTT состоит из двухэтапного колоночного процесса, сначала с аффинной очисткой против FLAG, а затем с SEC на колонке для гель-фильтрации с подходящим диапазоном разделения для HTT (, рис. 2A ; см. Table of Materials для Примеры).После обеих стадий HTT был получен с чистотой образца >95%, как определено с помощью SDS-PAGE с кумасси синим, и содержанием мономера >65% на основе аналитической SEC-MALS. Поскольку как длительное время очистки, так и температура оказывают негативное влияние на конечное содержание мономера HTT, FPLC использовали на обеих стадиях очистки, чтобы свести к минимуму манипуляции и получить стабильное качество образца. Основным загрязнителем во время очистки против FLAG был шаперон Hsp70, как определено с помощью масс-спектрометрии (, фигура 2B, , дорожка 2).Это согласуется с открытием, что Hsp70 совместно очищается с FL HTT, стабильно экспрессируемым в линиях клеток человека , 24, , что позволяет предположить, что Hsp70 может быть общим стабилизатором для FL HTT in vivo .

Загрязнение

Hsp70 можно устранить путем тщательной промывки хлоридом магния и АТФ на этапе аффинной очистки против FLAG (, рис. 2B, , дорожка 1). После удаления Hsp70 FL HTT склонен к образованию олигомеров более высокого порядка 24 , и его необходимо поддерживать в концентрации ≤ 1 мг/мл.Стадия концентрирования перед SEC часто может приводить к значительной агрегации. Таким образом, наилучшей практикой является прямая загрузка пиковых фракций после очистки против FLAG в гель-фильтрационную колонку без концентрирования. После SEC образец концентрировали до ≤1 мг/мл для максимального извлечения мономерного FL HTT. Количество HTT, полученное на каждом этапе очистки, оценивали либо с помощью кумасси синего, либо с помощью количественного вестерн-блоттинга с использованием очищенного FL HTT в качестве стандарта количественного определения (, таблица 2, ).Типичный выход очищенных белков FL HTT, полученных описанным способом, составляет примерно 1 мг/л клеточной культуры, но может быть значительно ниже этого значения (, таблица 3, ) из-за изменчивости от партии к партии или из-за очистки против FLAG. смола используется многократно.

Сверхэкспрессия FL HTT может привести к фрагментации белка 22 . FL Q23-HTT, полученный описанным здесь способом, разрешался как одна полоса с правильной молекулярной массой 350 кДа с помощью SDS-PAGE, окрашенного либо Кумасси G250, либо окрашиванием серебром (, фигура 2C, ).При вестерн-блоттинге FL Q23-HTT реагировал с антителами, индуцированными против эпитопов в N-концевом, С-концевом и нескольких промежуточных доменах, при этом не наблюдалось дополнительных полос, связанных с фрагментами, что указывает на то, что белок был выделен без значительных обнаружимых усечений (). Фигура 3A ). Варианты длины полиQ FL HTT Q23, Q48 и Q73 реагировали, как и ожидалось, в вестерн-блоттинге, показывая прогрессивно более сильный сигнал для полиQ-направленных mAb MW1, коррелирующий с увеличением длины Q: Q23-HTT < Q48-HTT < Q73-HTT (рис. ). 3В ).Никакого сигнала для ΔExon1-HTT (91-3,144 а.о.) не наблюдалось при зондировании антителами MW1 и MAB549, которые нацелены на N-концевой экзон 1 (, фигура 3B, ).

SEC-MALS использовали для анализа агрегатного состояния и молекулярной массы очищенного белка HTT. Образцы анализировали с помощью аналитической SEC, контролируемой детекторами UV, MALS и dRI. Абсолютная молярная масса, полученная из SEC-MALS, не зависит от формы молекул 33 , 34 ; таким образом, SEC-MALS обеспечивает объективную оценку MW для мономерных и олигомерных фракций, когда они хорошо разделены.Среди испытанных колонок для ВЭЖХ колонка для SEC (см. Таблицу материалов ) показала достаточное разрешение между мономером и димером HTT, так что можно было различить молярные массы ( Рисунок 4 ). Концентрацию белка определяли детектированием dRI. Приращения показателя преломления (dn/dc) FL HTT составляют 0,1853 мл/г, как рассчитано с помощью программного обеспечения SEDFIT 35 . Сходные аналитические модели элюции SEC наблюдались для ΔExon1 HTT (91–3,144), FL Q23, Q48 и Q73 HTT (1–3,144), каждая из которых состояла из основного мономерного пика с второстепенными димерными и олигомерными пиками (, таблица 4, ). Расчетная ММ для мономерной формы больше, чем теоретическая ММ. Это, вероятно, вызвано перекрывающимися видами олигомерных пиков более высокого порядка и ошибками, возникающими из-за слабых сигналов dRI, поскольку белки HTT поддерживаются в низкой концентрации, чтобы избежать образования олигомеров более высокого порядка. При интегрировании УФ-пиков нескольких партий очищенных вариантов FL HTT не наблюдалось четкой корреляции между длиной полиQ и профилем агрегата (, таблица 4, ).

В дополнение к аналитической SEC был проведен традиционный нативный PAGE, чтобы определить, можно ли его использовать в качестве дополнительного метода для характеристики олигомерного состояния FL HTT.Олигомеры более высокого порядка разделяли в 3-8% трис-ацетатных гелях с использованием нативного буфера без детергента. Очищенный FL HTT из SEC показал несколько полос, соответствующих состояниям олигомеризации (, фигура 5A, ). Самая нижняя полоса была расположена между нативным маркером 480 кДа и 720 кДа, аналогично предыдущим результатам, полученным для FL HTT, очищенного от клеток насекомых 22 . Однако мономер HTT не был наиболее распространенной полосой при использовании традиционного нативного PAGE, и результаты не коррелируют с профилем агрегатов, определенным с помощью аналитической SEC-MALS.Несколько гидрофобных участков, присутствующих в FL HTT 36 , 37 , 38 , особенно гидрофобный интерфейс между HAP40 и FL HTT 25 , вероятно, способствуют образованию гополимеров более высокого порядка во время миграции. внутри геля. Это связано с тем, что известно, что гидрофобные области взаимодействуют друг с другом в отсутствие детергента или стабилизирующих белок-белковых взаимодействий. В соответствии с гидрофобными свойствами HTT, FL HTT образует увеличивающиеся количества олигомерных фракций более высокого порядка в отсутствие CHAPS на этапе очистки SEC.

Blue Native PAGE, который широко используется для исследования мембранных белков и крупных белковых комплексов, содержащих гидрофобные участки 39 , сравнивали с традиционным нативным PAGE. Очищенный HTT показал три основные полосы на Blue Native PAGE с расчетной молекулярной массой 643, 927 и 1070 кДа (, рис. 5B, ), которые, вероятно, представляют собой мономерные, димерные и тримерные виды HTT соответственно. Полоса мономера оставалась наиболее распространенной полосой в Blue Native PAGE, что хорошо соответствовало аналитическому профилю SEC тех же образцов.Завышение молекулярной массы мономера HTT с помощью Blue Native PAGE может быть результатом уникальной полой сферической структуры или гидрофобных областей HTT, которые вызывают более медленную миграцию по сравнению с соответствующими маркерами молекулярной массы . В целом, FL Q23-HTT, FL Q48-HTT, FL Q73-HTT и ΔExon1-HTT имеют сходные профили Blue Native PAGE с небольшими различиями в миграции белковых полос из-за различий в их молекулярной массе.

В качестве дополнительной проверки качества очищенных белков С-концевая метка FLAG может быть удалена из FL HTT путем обработки протеазой TEV. После протеолитического расщепления образцы анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием четырех антител для подтверждения удаления метки FLAG и обнаружения деградации HTT. Иммунореактивность к анти-FLAG M2 и трем хантингтин-специфическим антителам с эпитопами на N-конце, промежуточных доменах и С-конце HTT показала успешное удаление метки FLAG и отсутствие продуктов деградации, специфичных для HTT (, дополнительная фигура S1) .


Рисунок 1 : Конструкция для полноразмерной экспрессии HTT. ( A ) Полноразмерный Q23 HTT был оптимизирован по кодонам и клонирован в плазмиду pcDNA3.1 (+). 3′-конец HTT был помечен эпитопом Flag и сайтом расщепления протеазой TEV с получением белка HTT без метки. Полиглутаминовый участок и домен, богатый пролином, были сконструированы с фланкированными сайтами эндонуклеазы рестрикции HindIII для вставки дополнительных повторов CAG с использованием кассетного клонирования, 90–121 i.e., Q48 и Q73, для получения вариантов HTT с различной длиной полиQ. ( B ) Конструкция ΔExon1 подвергалась ПЦР-мутагенезу с использованием pcDNA3. 1-Q23-HTT в качестве матрицы. Остатки 91-3144 HTT оставались в конструкции ΔExon1 для экспрессии. Сокращения: HTT = хантингтин; ЦМВ = цитомегаловирус; Q23 = полиглутаминовый стретч; PRD = домен, богатый пролином; TEV = сайт расщепления вируса травления табака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2 : Крупномасштабная очистка HTT. ( A ) SEC-профиль полноразмерного Q23-HTT, очищенного против флага, на колонке FPLC. Помечены олигомеры высокого порядка, пики димеров и мономеров Q23-HTT. Фракции, содержащие мономер, собирали в качестве конечной пробы ГТТ. ( B ) SDS-PAGE очищенного Q23-HTT со стадией промывки АТФ/магнием (дорожка 1) или без промывки АТФ/магнием приводит к совместной элюции Hsp70 (дорожка 2). ( C ) Окончательные очищенные полноразмерные варианты HTT на SDS-PAGE, окрашенные кумасси синим G-250 или серебряным красителем. Сокращения: FL = полная длина; HTT = хантингтин; SEC = эксклюзионная хроматография; FPLC = быстрая белковая жидкостная хроматография; О = олигомер; D = димер; М = мономер; SDS-PAGE = электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия; Hsp70 = белок теплового шока 70. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 3 : Вестерн-блот анализ очищенных вариантов HTT. ( A ) Очищенный FL Q23-HTT анализировали на SDS-PAGE и переносили на мембрану PVDF.Первичными антителами и взаимодействующими эпитопами являются дорожка 1, α-FLAG M2, метка FLAG; Переулок 2, MAB5492, HTT aa. 1-82; полоса 3, MAB5490, HTT а.о. 115-129; дорожка 4, MAB2166, HTT аа 181-810; Дорожка 5, MAB3E10, HTT а.о. 1,171-1,177; Дорожка 6, MAB4E10, HTT а.о. 1,844-2,131; дорожка 7, MAB2168, HTT а.о. 2,146-2,541; Дорожка 8, MAB8A4, HTT а.о. 2,703-2,911. ( B ) 1 мкг очищенных вариантов FL HTT анализировали в SDS-PAGE и переносили в PVDF (слева), а затем анализировали дубликат геля SDS и окрашивали кумасси синим (справа). Первичные антитела и взаимодействующие эпитопы представляют собой Row 1, MW1, расширенные повторы PolyQ; ряд 2, MAB5492, HTT а.о. 1-82; Ряд 3, МАВ2166, НТТ аа 181-810. Сокращения: FLL Q23-HTT = белок хантингтина полной длины, содержащий 23 остатка глутамина; SDS-PAGE = электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия; WB = вестерн-блоттинг; М = маркер; ПВДФ = поливинилиденфторид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 4 : Анализ SEC-MALS полноразмерного HTT. Очищенный полноразмерный Q23-HTT элюировали на колонке UPLC. Указаны положения пиков предсказанных мономера, димера и олигомера. Молекулярные массы были рассчитаны для мономерных, димерных и тримерных пиков и перечислены в таблице 5 . Аналогичные профили элюции наблюдаются для Q48, Q73 и ΔExon1 HTT с различным содержанием мономера, димера и олигомера при каждой очистке. Сокращения: SEC-MALS = эксклюзионная хроматография с многоугольным светорассеянием; УФ = Ультрафиолетовый; LS = светорассеяние; MW = молекулярная масса; Q23-HTT = белок гентингтин, содержащий 23 остатка глутамина; М = мономер; D = димер; О = олигомер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 5 : Характеристика очищенного HTT с использованием прозрачного геля Native PAGE или синего геля Native PAGE. Нативный маркер и кажущийся мономерный Q23-HTT из SEC были разделены на 3-8% трис-ацетатных гелях в неденатурирующей системе PAGE ( A ) и системе Blue Native PAGE ( B ). Сокращения: FL = полнометражный; Q23-HTT = белок гентингтин, содержащий 23 остатка глутамина; PAGE = электрофорез в полиакриламидном геле; М = маркер.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Ступенька Имя Состав
6.1.1 Буфер А 50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 5 % об. /об. глицерина, 5 мМ ЭДТА, 0,01% об./об. Tween-20, pH 8,0.
6.1.2 Буфер для лизиса 50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 5% об./об. глицерина, 5 мМ ЭДТА и 1 коктейль ингибиторов протеазы
6.1.4.2 Буфер А 50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 5 % об./об. глицерина, 5 мМ ЭДТА, 0,01% об./об. Tween-20, pH 8,0.
6.1.4.3 Буфер В 50 мМ Трис; 500 мМ KCl; 5 мМ MgCl2; 5% объем/объем глицерина; 0,01% об./об. Твин-20, рН 8,0
6.1.4.4 Буфер С 20 мМ Трис; 200 мМ KCl; 5 мМ MgCl2; 5 мМ АТФ; 0,01% об./об. Твин-20; 5% объем/объем глицерина, pH 8,0
6.1.4.5 Буфер D 50 мМ Трис; 500 мМ NaCl; 5% объем/объем глицерина; 5 мМ ЭДТА; 0.5% мас./об. CHAPS, pH 8,0
6.1.4.6 Буфер для элюции 50 мМ Трис; 500 мМ NaCl; 5% объем/объем глицерина; 0,5% мас. /об. ГАПЦ; 0,2 мг/мл пептида DYKDDDDK, pH 8,0
6.1.6 Буфер регенерации 0,1 М глицин HCl, рН 3,5; 0,01% об./об. Твин-20
6.2.1 SEC-буфер 50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 5 % (об./об.) глицерина, 0,5 % (вес./об.) CHAPS, 1 мМ TCEP
7.3 SEC-MALS Буфер 50 мМ HEPES, pH 7,2, 500 мМ NaCl, 5 % (об./об.) глицерина, 0,5 % (вес./об.) CHAPS
8,7 Раствор для удаления пятен 40 % об./об. метанола и 7 % об./об. уксусной кислоты
9.4.2 Раствор для окрашивания кумасси 0,01 % вес./об. Coomassie G250, 50 % об./об./метанол, 10 % об./об. уксусная кислота
9.5.1 Фиксирующий раствор Метанол 50 % об./об., уксусная кислота 10 % об./об., 50 мкл формальдегида/100 мл раствора

within-page=»1″> Таблица 1: Состав буферов и растворов

Ступени Концентрация HTT (мг/мл) Общий объем (мл) Содержание ГТТ (мг) Выход HTT на ячейку (пг/ячейку) % Выход
Супернатант 0.1792 220 39,4 4,4 100
Антифлаг 1,524 8,6 13,1 1,47 33,4
СЕК 0,91 3,9 3,54 0,4 9,1

Таблица 2: Выход HTT из 2 л осадка HEK293, трансфицированного pcDNA3.1-Q23- HTT -TEV-Flag. Сокращения: FL Q23-HTT = белок хантингтина полной длины, содержащий 23 остатка глутамина; TEV = сайт расщепления вируса травления табака; SEC = эксклюзионная хроматография.

Образец HTT HTT Выход (мг/л) Средняя чистота (%)
БКА А 280
1 FL DEx1-HTT (N=3) 0.67-1.30 0,69-1,18 99,3
2 FL Q23-HTT (N=3) 0,25-0,92 0,28-0,98 96,9
3 FL Q48-HTT (N=3) 0,28-1,15 0,38-1,16 97,4
4 FL Q73-HTT (N=3) 0,58-1,05 0,57-0,97 98,8

within-page=»1″> Таблица 3: Сводка по выходу белка при очистке четырех вариантов FL HTT и их конечной чистоте. Аббревиатура: FLL HTT = белок хантингтина полной длины.

Образец HTT А Д М
FL Q23-HTT 4,2-6,9% 18,7-29,3% 66,5-76,0%
FL Q48-HTT 4,0-9,4% 10,6-17,8% 73,6-85,4%
FL Q73-HTT 2.0-14,0% 16,9-24,6% 65,1-81,1%

Таблица 4: Сводка репрезентативного содержания агрегатов, димеров и мономеров вариантов FL HTT после очистки. Сокращения: FL HTT = белок хантингтина полной длины; А = агрегат; D = димер; М = мономер; SEC = эксклюзионная хроматография.

Дополнительный рисунок S1: Вестерн-блот анализ после расщепления протеазой TEV. Очищенные FL Q23-HTT и FL Q48-HTT анализировали в SDS-PAGE, переносили на мембраны PVDF и анализировали с помощью вестерн-блоттинга после расщепления TEV.Первичными используемыми антителами были анти-Flag M2 (флаг-метка), MAB5492 (HTT а.о. 1-82), MAB3E10 (HTT а.о. 997-1,276) и MAB2168 (HTT а.о. 2,146-2,541). дорожка 1, белковый стандарт; полоса 2, флаг Q23-HTT-TEV; полоса 3, флаг Q48-HTT-TEV; Дорожка 4, Q23-HTT-TEV-Flag, обработанный протеазой TEV в соотношении 1:5, в течение ночи при 4 °C; Дорожка 5, Q48-HTT-TEV-Flag, обработанный протеазой TEV в соотношении 1:5, в течение ночи при 4 °C. Сокращения: FL HTT = белок хантингтина полной длины; SDS-PAGE = электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия; TEV = вирус травления табака; ПВДФ = поливинилиденфторид.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Анализ SEC-MALS вариантов FL HTT, подвергнутых циклам замораживания-оттаивания. Очищенные Q23-HTT ( A ) и Q48-HTT ( B ) замораживали при -80 °C и оттаивали при комнатной температуре до 6 раз. Q23-HTT и Q48-HTT после первого цикла замораживания-оттаивания и шестого цикла замораживания-оттаивания затем анализировали с помощью SEC-MALS. Небольшое уменьшение доли мономеров и увеличение доли димеров и олигомеров высокого порядка наблюдали по светорассеянию после повторных циклов замораживания-оттаивания.Указаны положения пиков предсказанного мономера, димера и олигомера высокого порядка. Сокращения: FL HTT = белок хантингтина полной длины; О = олигомер; D = димер; М = мономер; SEC-MALS = Эксклюзионная хроматография с многоугольным светорассеянием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: SDS PAGE вариантов FL HTT, подвергнутых циклам замораживания-оттаивания. Очищенный Q23-HTT ( дорожек 2 7 ) и Q48-HTT ( дорожек 9 14 ) замораживали 6 раз при комнатной температуре до -80 °C и оттаивали .

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.