Как нарисовать 99 ладу: Как нарисовать девятку карандашом поэтапно

Содержание

Как нарисовать девятку карандашом поэтапно

Очень серьезные ребята попросили меня показать как рисовать девятку карандашом. Дескать, эта машина навевает на них теплые, приятные воспоминания, и хотят запечатлеть их на бумаге. Посвящаю этот урок вам, ребята. А в качестве примера возьму одну фотографию машины:

Девятка — легенда отечественных дорог. Лайт версия КАМАЗа. Хард версия советского велосипеда Спутник. Это машина романтиков и знатоков. Знать нужно все! Когда долить тосол, менять термостат, передние стойки… И не потому, что нет СТО, просто такая беда может случиться в самый неожиданный момент и нужно уметь справиться с ней самостоятельно. Эй дэвушка, садись прокачу! Та дверь открывается? А эта? Ну дерни сильнее, только не оторви. Главное едет, уже не пешком. Еще немного и ты дома. А какие достоинства у этой модели:

Недорого, доступно, легкий ремонт;
Почти не расшатанные сидения;
Пимпочка, которая регулирует подголовники, имеет форму похожую на множество предметов, если что – можно заменить;

Изобилие штучек и примочек, особенно радует магнитола новой модели на две кассеты;
Минималистический дизайн и хорошо продуманная конструкция позволяет легко маневрировать по родному бездорожью.

Кроме того, она приносит много радости авторемонтникам и ГИБДД. Надеюсь, она принесет радость и вам, ну хотя бы на бумаге:

Как нарисовать девятку карандашом поэтапно

Шаг первый. Сделаем геометрическую форму параллелепипеда (надеюсь, вы знаете что это). В нее впишем машинку.

Шаг второй. Набросаем каркас девятки легкими длинными штрихами.

Шаг третий. Начнем прорисовывать все части более детально.

Шаг четвертый. Добавим теней для реалистичности, вуаля – даже лучше чем вживую:

Попробуйте изобразить еще другие виды транспорта:

ВАЗ 2115;
Бумер черный;
Жигули;

Рисунок машины лада приора.

Как нарисовать приору карандашом поэтапно

Как поэтапно нарисовать Ладу Приору

Этап 1

Несмотря на плавность линий, начинать работу над изображением мы будем с прямых, формирующих силуэт кузова машины. Расположение авто на рисунке — поворот в 3/4. Этот удачный ракурс дает возможность рассмотреть детали, не потеряв целостности образа.

Этап 2

Получив основу для рисунка, переходим более четкому обозначению контура: рисуем капот, колесные арки, низ бампера, плавный переход задней стойки. Эта плавность — новая черта в сравнении с «десяткой». Наносим решетку радиатора, фары, бампер целиком, боковые и переднее стекла, зеркало, колеса.

Этап 3

Обозначаем все мелкие детали: стеклоочистители, диски, фонари.

Этап 4

С эскиза убираем линии черновика-основы, проверяем все контуры, делаем их более четкими.

Этап 5

Выполняем рисунок в цвете. Придавая изображению объем, делаем светлее выпуклые части кузова машины.

Обычный Камаз

Сначала попробуем нарисовать Камаз поэтапно с открытым кузовом.

Этап 1

Чем правильнее будет предварительный эскиз, тем лучше выйдет результат. Для грузовика наиболее подходящим будет такой вариант:

Этап 2

На полученном наброске прорисовываем части автомобиля: кузов, кабину. Также намечаем фары, стекла и колеса.

Этап 3

Теперь нужно проработать все детали. Внизу – подвеска, дальше – бак. Бампер с двумя парами фар, зеркала заднего обзора, дождевые щетки, номерной знак.

Этап 4

Перед нанесением теней необходимо удалить лишние и вспомогательные линии. Рисунок готов.

Как нарисовать Приору карандашом

Выполним карандашный рисунок приоры в профиль. Покажем ее стремительный силуэт и четкие линии.

Поле на листе, где будет рисунок, твердым карандашом, оставляющим тонкие линии, оформляем в виде прямоугольника, состоящего из 4 квадратов. Каждый квадрат делим пополам горизонтальной линией. Опираясь на этот чертеж, нам будет проще соблюдать пропорции авто.

Приступаем к нанесению линий кузова, показываем двери, крышу, передний и задний бампер.

Убрав ластиком тонкие контуры нашей вспомогательной разметки, добавляем в рисунок колеса, дверные ручки, пороги, все линии делаем четкими с помощью мягкого карандаша.

Как нарисовать «Приору» простым карандашом легко и без художественных навыков

«Лада Приора» — хороший автомобиль в своей ценовой категории. Обладает неплохими качествами. Что и привлекает молодежь, которая получает права и для опыта смиряется с любой машиной, лишь бы было на чем покататься.

Это делает данную модель транспортного средства довольно популярной. Не зря подростки задаются вопросом о том, как нарисовать «Приору». Ведь некоторые еще в школе сидят на уроках, забыв об учителе, и думают о желанном авто, о скорейшем наступлении совершеннолетия. В такие моменты на скучных уроках себя можно занять мыслями о машине, а чтобы она поскорее появилась наяву, нужно отразить мечты на бумаге. Поэтому полезно будет узнать, как нарисовать «Ладу Приору» карандашом.

Подготовительный этап

Опираясь на нижеприведенный урок, можно без особых навыков научиться рисовать. Для этого понадобится лист бумаги, можно тетрадный, карандаш (хватит одного, покупать набор не нужно). Возьмите ластик, если карандаш простой, а не цветной. Он не так важен, но если отсутствует опыт в данном занятии, то лучше подстраховаться. Когда вы соберете все, что необходимо, можно приступать к изучению того, как нарисовать «Приору». Работа легкая и интересная.

Рисунок вида сзади

Для начала проще научиться рисовать вид сзади, а потом, набравшись опыта и умений, можно попробовать другой ракурс. Лучше иметь при себе два карандаша: мягкий и твердый. Первый подойдет для создания набросков, так как впоследствии легко стирается ластиком, а второй нужен, чтобы прорисовать детали.

Итак, как нарисовать «Ладу Приору» карандашом поэтапно?

Наброски и передняя часть

Первым делом создается набросок. Легким надавливанием карандаша на бумагу нарисуйте две параллельные, немного наклоненные линии и одну внизу. Сквозь них проходят две кривые с левого бока, а с правого такие же внизу. Между последними проходит еще один отрезок (похоже на букву «н»).

Теперь приступаем к подробному разбору переднего крыла. Один из контуров делаем более четким. Дорисовываем перед, ручку двери и арку под колесо. Линии должны быть плавными, изогнутыми, чтобы изображение не выглядело плоским.

Придаем четкость средней боковой части переда. Добавляем линии внизу, показывающие то, что авто находится в движении.

Картинка все больше становится похожа на настоящую. Занимаемся прорисовкой деталей машины. Нарисуйте переднее зеркало, но нельзя делать это простым прямоугольником, так картинка получится плоской. Набросайте форму параллелограмма, действуйте исходя из него, прочерчивая крепление к автомобилю и бортики, с левой стороны они должны быть больше.

Прорисовка и задняя часть

Сейчас начинается этап прорисовки заднего крыла с дверью. Начинаем с арки будущего колеса, изображаем по тому же принципу, что и арку у переднего. Обводим прямую линию, которая у нас еще осталась с первого этапа. Схематично показываем линии бампера.

Тут становится понятно, что алгоритм того, как нарисовать «Приору», простой. Если вначале все как-то не сходилось, надо было стирать и перерисовывать, то с крышей все намного легче. Делаем набросок линий крыши, размечаем окна.

Приступаем к созданию багажника и кузова. Прорисуйте уже имеющиеся линии и добавьте некоторые элементы. Фары сделайте светодиодными, это значит, что внутри формы есть овал и кружок. Нарисуйте место под номерной знак, это должно быть похоже на параллелограмм с округленными снизу краями.

Теперь дополняем нижнюю часть заднего бампера дополнительными линиями и деталями.

Колеса

Доделываем колеса, арки для которых уже есть. В арках рисуем два полукруга, один, который поменьше, внутри другого. И еще один круг в центре. Буквально две линии помогают добиться объема у шин.

Так как автомобиль изображается в движении, добавляем немного штрихов на колесах.

Как нарисовать «Приору» без классных, модных дисков? Это невозможно! Добиться нужного эффекта позволят круги разных диаметров. Необязательно делать их штампованными, можно нарисовать обычные диски или любые другие.

На заключительном этапе уберите все лишние линии, которые были вначале, а основные обведите более ярко.

Если под рукой есть только карандаш, то работа готова, но при наличии цветных карандашей, ручек или красок рисунку лучше добавить цвета.

Теперь вы знаете, как нарисовать машину «Лада Приора» поэтапно. Научившись изображению вида сзади, приступайте к изучению переда. Смотрите больше фотографий и срисовывайте.

fb.ru

Как нарисовать приору БПАН

Автомобиль с заниженной подвеской, Приору БПАН, мы нарисуем, акцентируя внимание на задней части машины. Знакомый уже силуэт рисуем без вспомогательных линий, используя твердый карандаш.

Акцентируя внимание на низком дорожном просвете, прорисовываем детали, выполняем рисунок в эффектном черно-белом цветовом сочетании.

Предлагаем посмотреть на рисунки Приоры БПАН, выполненные разными авторами. Возможно, вы возьмете на заметку чью-нибудь изобразительную находку.

Рисуем Приору Хэтчбек

Теперь изобразим Приору с другим типом кузова — хэтчбек, с укороченным задним свесом. Модель слегка короче седана и, почти неуловимо для глаза, выше.

Линии передней части нам хорошо знакомы, уделяем внимание бокам кузова, которые, как говорят эксперты, выглядят особенно эффектно. Не торопясь, тщательно прорисовываем все линии сначала твердым карандашом, потом выделяем их мягким. Только после того, как карандашный эскиз доведен до совершенства, переходим к добавлению цвета.

Рисуя Приору хэтчбек карандашом или гуашью, стараемся передать в изображении ее азартный, спортивный характер.

Видео уроки

Лада Приора относится к семейству отечественных легковых автомобилей, производителем является ОАО «АвтоВАЗ». В апреле 2007 года началась продажа этой модели. Немного позже начали выпускать эту модель с кузовом хэтчбек. А в 2009 году началось производство этой модели в модификации кузова универсал.

В дальнейшем планируется изменение внешнего вида переднего бампера, будут заменены наружные зеркала с боковыми указателями поворота и добавлены дополнительные опции. Так же совсем недавно начали выпускать эту модель с автоматической коробкой передач.

Кроме этого на базе Лады Приоры планируется создание электромобилей, которые в ближайшее время появятся в небольшом количестве. Лада Приора дает понять потребителю, что и отечественные автомобили могут быть презентабельного вида, как и иностранные машины.

Пошаговая инструкция. Как нарисовать Приору:

Для начала стоит иметь при себе наглядный образец этой модели, то с чего мы будет срисовывать.
Теперь мы рисуем каркас нашего рисунка. Сначала рисуем основной контур, а потом проводим вертикальные, наклонные и горизонтальные линии, отталкиваясь от нашего наглядного изображения.
Затем придаем форму капоту, проводим линию боковых окон по верху и рисуем колесные арки. После этого прорисовываем переднего бампера снизу.
Теперь прорисовываем боковые стекла, боковое зеркало заднего вида, лобовое стекло и фары головного света. Теперь необходимо прорисовать «мордочку» нашей Приоре.
Далее нужно прорисовать форму видимых нам колес. Потом дорисовываем зеркало заднего вида, уже справа, боковую юбку, накладки на передний бампер, и линии боковых дверей.
Теперь нужно детализировать наше авто, прорисовываем фары головного света, колесные диски, ручки, дворники и прочую мелочь. Как все такие детали будут прорисованы, можно будет стереть лишние линии, которые мы провели при рисовании каркаса.
Ну, вот Лада Приора готова и теперь вы знаете, как нарисовать Ладу Приору.

Но есть еще один вариант рисования Приоры карандашом. Он не такой подробный, но ясный и доступный. Давайте рассмотрим и его:

Для начала рисуем корпус машины и передние колеса.
Затем дорисовываем задние колеса, фары и другие мелкие детали, такие как стекла заднего вида, линии дверей, ручки и так далее.
Обрисовывает машину более жирной линией.
Наносим тень и на месте номеров пишем Lada Priora.

Эти два простых способа помогут вам узнать, как нарисовать Приору карандашом. Теперь вы можете самостоятельно попробовать нарисовать эту модель отечественного автомобиля и, скорее всего, она у вас прекрасно получиться.

«Лада Приора» — достаточно популярная среди молодых людей машина отечественного производства. Многие считают, что данная модель ничем не хуже некоторых иномарок. Владельцы такой машины просто влюблены в неё, они ездят в ней по городу и делятся опытом, впечатлениями с друг другом. Сейчас стало популярным рисовать «Приору» БПАН, это достаточно легко, для этого не нужно даже заканчивать художественную школу. Как нарисовать «Приору»? Легко, нужно следовать инструкции!

Как нарисовать Ладу Приору карандашом поэтапно

Лада Приора – трансформер в нерабочем состоянии, выпускаемый ВАЗом, с периодом полураспада не больше одного года. Чаще всего передвигается на четырех колесах, если передвигается вообще. Сначала Лада была задумана как советская радистка-шпион, внедряемая в немецкий тыл, но из-за маленьких госзаказов пришлось переплавлять её на автомобиль, поэтому вид у неё весьма скверный. Чаще всего для экономии кинетической энергии из возможных четырех дверей открывается только водительская, а капот оснащен автоматическим механизмом, который открывается только после поломки двигателя. Внешнее сходство Лады с автомобильным транспортом настолько сильно, что честный русский человек и не задумывается при покупке, а химические составы, выделяемые в салоне, заставляют его любить Ладу и всячески её поощрять. Что можно сделать с Ладой:

Можно превратить транспорт в моноблок с одной дверью сзади. Так вы сэкономите на дверных ручках, боковых стеклах и укрепите корпус;
Если вы холостяк, можно убрать все кресла, кроме водительского. Так вы увеличите пространство внутри автомобиля и сможете перевозить в салоне в 3 раза больше веса, либо одну целую живую корову;
Убрав крышу, вы легко можете превратить вашу Приору в ванну на колесах;
С помощью невидимого шнура вы можете передвигаться даже без бензина, если привяжете автомобиль к другому транспортному средству;
В фильме Трансформеры не использовалась Лада и другие произведения ВАЗа по причине неопределенности принадлежности этого аппарата к транспортным средствам;
В американских фильмах Приора никогда не взорвется, если внутри неё нету медведя в шапке-ушанке.

А сейчас вы сами попробуете нарисовать этот автомобиль карандашом.

Как нарисовать Ладу Приору карандашом поэтапно

Шаг первый. Нарисуйте корпус автомобиля и передние колеса.

Шаг второй. Добавьте фары, задние колеса и другие детали. Шаг третий. Обрисуйте все более жирной линией.

Шаг четвертый. Оттените и напишите вместо номеров Lada Priora.

Еще несколько интересных уроков на похожую тематику:

Черный Бумер;
Спортивную Audi S5 Coupe;
ВАЗ 2115;
Жигули;

dayfun.ru

Как нарисовать отдельные элементы

Помимо вопроса, как нарисовать «Приору», уместен еще один: как изображать значок «Лады Приоры». Логотип машины должен присутствовать на рисунке, поэтому научиться его рисовать будет нелишним.

Первым шагом чертим овал. Затем рисуем внутри овала ещё один овал, а в нём — ещё один. С помощью линейки проводим прямые линии, тем самым разделяя овалы на равные части. После начинаем изображать сам значок. Как только появился логотип, можно убирать вспомогательные линии!

Современный автопром удивляет и радует поклонников автомобилей колоссальным разнообразием моделей, которые всего несколько лет назад даже представить себе было сложно, соответственно и возможностей для художественного изображения появилось значительно больше. Но чтобы реализовать этот творческий порыв и нарисовать машину, нужно знать некоторые тонкости.

Как нарисовать «Приору» БПАН поэтапно? :: SYL.ru

Как нарисовать «Приору»

Начинающим лучше учиться рисовать по инструкции, которая поможет решить вопрос, как нарисовать «Приору» БПАН. Даже человек, который никогда не мог похвастаться своими художественными талантами, может изобразить прекрасную машину. Выполнять рисунок лучше карандашом, дабы можно было стереть лишнее или подправить какой-либо недостаток.

Инструкция

Итак: как изобразить «Приору» БПАН карандашом?

Первым делом, как и во всех рисунках, делаем набросок: две параллельные линии сверху и одна снизу, между ними нужно показать две кривые линии с обеих сторон.
Начинаем детализировать «Приору». Первое, что мы будем изображать, — это левое крыло машины. Контур крыла должен быть выгнутым. Под ним рисуем выемку, в которой разместится колесо. Для более естественного вида контур делается двумя линиями.
Третим шагом инструкции, как нарисовать «Приору», будет прорисовка боковой стороны автомобиля, также отмечаем низ.
Четвёртый шаг: настало время избражать дверь и крыло. Для этого чертим параллельную по отношению к нижней части автомобиля прямую. Далее, показав арку для колеса, создаем наброски заднего бампера автомобиля.
Пятый шаг инструкции, как нарисовать «Приору»: изображаем крышу, от неё вниз проводим прямые линии от переднего и среднего окон.
Шестой — рисуем мелкие детали автомобиля, зеркала.
Седьмой — изображаем заднюю часть автомобильного кузова. Там нужно показать багажник, а также фары.
Восьмой шаг — обязательно нужно прорисовать каждую деталь заднего бампера.
На девятом шаге инструкции, как нарисовать «Приору», приступаем к рисованию колёс автомобиля. Это нужно делать двумя линиями, чтобы показать толщину колеса.
Десятый — доводим до совершенства колёса «Приоры».
Одиннадцатый — показываем круги на диске автомобиля.
Двенадцатый — убираем лишние линии, дорабатываем изображение и разукрашиваем для того, чтобы оно выглядело лучше.

С инструкцией, как нарисовать «Приору» БПАН карандашом поэтапно, сможет разобраться любой человек и изобразить прекрасную машину!

Как нарисовать отдельные элементы

Как видим, нарисовать «Ладу Приору» БПАН несложно!

www.syl.ru

Рисуем Ладу Приору

Популярность автомобиля Лада Приора объясняется очень просто: хорошая цена, относительно неплохое качество, но и в случае непредвиденной ситуации на дороге не особо жалко. Так что для молодых людей, только получивших права, такая машина — прекрасный вариант. Вот и подростки с удовольствием занимаются графической материализацией своей мечты, а именно рисуют Приору БПАН.

Это интересно. Аббревиатура БПАН расшифровывается как Без Посадки Авто Нет и обозначает сообщество автомобилистов, которые предпочитают машины с изменённой подвеской в сторону уменьшения дорожного просвета.

Инструкция:

Начинаем с набросков машинки, то есть проводим две параллельные линии — вверху и внизу.
Начинаем рисунок с прорисовки вспомогательных линий
Между этими отрезками рисуем две изогнутые линии с двух сторон.
Принимаемся за левое крыло, делая его контур чуть выгнутым слева.
Под ним арка для переднего колеса. Чтобы линия арки была более объёмной, делаем её двойной.
Для объёма арки делаем её линию двойной
Прорисовываем среднюю и боковую части машинки.
Линию двери делаем изогнутой
Следующая задача — показать заднюю дверь и крыло. Делаем линию параллельную нижней части кузова.
Показываем арку под колесом.
Намечаем линию заднего бампера.
Прорисовываем линии бампера, арки под заднее колесо и нижней части кузова
Приступаем к крыше. Делаем два перпендикуляра переднего и среднего окон. Выводим плавной линией покатое заднее стекло.
Линии лобового стекла и крыши должны быть плавными
Прорисовываем заднюю часть кузова: багажник с небольшим кружком и овалом — светодиодными фарами.
Внизу добавляем номерной знак.
Работаем над изображением заднего бампера. Показываем небольшим прямоугольником светоотражающий элемент.
Завершаем рисунок прорисовкой деталей заднего бампера
Под арками рисуем двойными линиями полукруги — колёса. Наводим мягким карандашом толщину колеса.
Прорисовываем несколько штрихов в центре и на шинах, а между этими линиями показываем мелкими кругами штампованные диски Лады.
Вытираем вспомогательные линии, наводим контур и по желанию раскрашиваем машину карандашами, фломастерами или красками.
Раскрасить рисунок можно простыми карандашами

Видео: как нарисовать Приору БПАН, начиная с лобового стекла

Видео: как профессионально нарисовать Приору

Как нарисовать ВАЗ 2115 карандашом поэтапно

Транспортные средства нужны, чтобы быстро и без усилий перемещать наши тела в заданном направлении. Однако в русской автомобильной промышленности такое встретить трудно. Здесь же приходится автомобиль ремонтировать больше, чем ездить на нем. Возможно, причиной этому стало то, что он должно ездить по дороге, а не по ямах. Внезапно оказалось, что в некоторых местах дороги есть, но машины все же отказываются быть приличным транспортом. Почему так происходит не понятно. Но всеже мы попытаемся узнать как рисовать ваз 2115.

ВАЗ – сокращение от Великий Адронный Запор, фирма по производству консервных банок и досок на колесах. Внешне продукт похож на машину, но при использовании самоуничтожается или отказывается сотрудничать из-за несовместимости рук разработчиков с инструментами. Для экономии средств логично будет сузить цикл использования автомобиля к Завод – Металолом, тогда все расходы окупятся.

Тем не менее, самовоз пользуется популярностью в обычного русского человека, ибо дешево и сердито, а в сочетании с дорогами не сразу поймешь, что хуже: ВАЗ или Бэха. Есть мысля, что их покупают террористы ближнего востока и используют как средство запугивания Америки и Европейских стран. Религиозные фанатики с радостью пользуются, так как сесть за руль ВАЗа – прямой путь в рай. С другой стороны, такое орудие мог придумать разве что сам Дьявол, получить шок от сделанного им кошмара, и со страху отправить его не Землю, от греха подальше.

Если у вас есть ВАЗ, то:

Вы точно живете в России или стране бывшего Советского Союза;
Вы ездите на работу пешком;
Машина – самое ваше дорогое приобретение после бритвенного станка;
Вы открыто поддерживаете отечественного производителя и именно поэтому в России так хорошо жить;
Летом вас продувает с лобового стекла, а температура внутри позволяет открыто коптить рыбу;
Продадите его, доложите еще 99% нужной сумы и купите автомобиль, который в состоянии передвигаться в пространстве-времени;

Рисуем поэтапно гоночную машину

Вряд ли можно найти любителя автомобилей, который был бы равнодушен к гоночным машинам. Скорость, мобильность и красота — вот что делает болиды такими популярными. Однако нарисовать это произведение автопрома не так-то и легко.

Инструкция:

Основное правило изображения гоночной машины — для начала передать на бумаге максимально упрощённый эскиз. В этом случае — начинаем с прорисовки корпуса вытянутой формы.
Начинаем рисунок со вспомогательных линий
Для придания объёма добавляем верхнюю часть — водительское и пассажирские места. По внешнему краю на основании проведённой параллельной внешнему краю линии строим каркас салона.
Для придания объёма прорисовываем линии крыши и каркас салона
Приступаем к нижней части. Проводим нижнюю линию, делая выемки для колёс.
Прорисовываем выемки под колёса, закругляем линию заднего бампера
Из-за того, что машина расположена под углом, колёса делаем овальными.
Из-за того, что машина расположена под углом, колёса не должны быть круглыми
Нижнюю часть автомобиля делаем изогнутой.
Для придания правильной формы закругляем переднюю часть корпуса
Приступаем к верху. Добавляем боковое зеркало и смягчаем первоначальные линии мягкими штрихами.
Смягчаем линии верха, дорисовываем боковое зеркало
Добавляем сбоку и сзади две линии болида.
Добавляем линии сбоку и сзади
Стираем лишние линии, прорабатываем детали. Начинаем с передних линий, добавляем фары.
Убираем лишние линии, рисуем фары
Прорисовываем линию внизу, а также прямоугольник для номера.
Дорисовываем номерной знак, детализируем линии автомобиля
Добавляем несколько линий на стёкла машины, а также линию двери.
Завершаем картинку прорисовкой дверей и деталей передней части автомобиля

Видео: два гоночных автомобиля, нарисованных по клеткам тетрадного листа

Как нарисовать пожарную машину

Современные пожарные машины существенно отличаются от тех, что впервые появились в 1904 году. В старых автомобилях помещалось 10 человек и практически ничего из пожарного инвентаря. А вот современные образцы настолько вместительны, что в них вмонтировано предостаточно инвентаря для тушения огня.

Инструкция:

Проводим три параллельные горизонтальные линии, которые делим пополам одной вертикальной.
Для пожарной машины нужно сделать четыре вспомогательные линии
В одной части рисуем кабину, начиная с верхней части, а затем дорисовывая почти вполовину выдающуюся нижнюю часть.
По нижнему краю делаем выемку под колёса.
Кузов изображаем в виде прямоугольника, с выемками под колёса по нижнему краю. Высота кузова — половина высоты кабины.
Начинаем рисунок с кабины и очертаний кузова
Прорисовываем колёса.
Кабине размечаем две правые двери.
Дорисовываем лестницу на кузове.
В колёсах не забываем о прорисовке дисков, для изображения лестницы можно использовать линейку
Добавляем фары, а также смотанный пожарный рукав, который закреплён сбоку.
Дополняем рисунок пожарным рукавом и надписью 01
Рисунок готов, по желанию его можно раскрасить.
Машину можно раскрасить простым карандашом, но если использовать краски, фломастеры или цветные карандаши, то основными оттенками будут красный и белый

Следующий способ нарисовать машину спецтехники будет интересен даже тем ребятам, которые не слишком сильны в рисовании.

Инструкция:

Рисуем прямоугольник и делим его вертикально пополам.
Основой этой машины будет разделённый вертикально пополам прямоугольник
В левой части прорисовываем кабину, проводим двойные линии для прорисовки окон, рисуем ручки.
В левой части рисуем кабину с двойными линиями окон
На кузове делаем окошки. Для этого нижнюю границу делаем чуть выше низа окон кабины.
Прорисовываем окошки на кузове
Сверху добавляем свёрнутый пожарный рукав, цистерну.
Дорисовываем на кузове цистерну и свёрнутый пожарный рукав
Дорисовываем колёса, линии делаем двойными.
Рисуем колёса
На крышу кабины устанавливаем проблесковый маячок.
Дорисовываем проблесковый маячок, детали инвентаря
Дорисовываем детали оформления автомобиля спецтехники (например, инструменты для тушения пожара, которые крепятся по внешней стенке нижнего прямоугольника).
Удаляем контурные линии, а основные наводим мягким простым карандашом или фломастером.
Машину можно раскрасить или оставить в варианте с наведёнными контурами

Видео: как ребёнку старше 3-х лет нарисовать пожарную машину маркером

Как нарисовать машину Лада Приора поэтапно карандашом

Здравствуйте, уважаемые пользователи! Я действительно очень рад, по вам не безынтересен сайт DragoArt.ru! За прошедшую неделю мне на почту пришло довольно много писем (а так же комментариев на сайте) с просьбой нарисовать «Приору». Раз эта тема столь популярна, было бы нехорошо заставлять вас, дорогие друзья, долго ждать. Вот я и создал урок о том, как нарисовать машину Лада Приора. Предлагаю немного познакомиться с этим «автомобилем, который мы видим каждый день и на котором многие ездят», а потом приступим непосредственно к уроку.

Лада Приора

— семейство российских легковых автомобилей, выпускаемое ОАО «АвтоВАЗ» и относимое по европейской классификации.

В марте 2007 года с конвейера сошлb чуть более тысячи седанов Priora, 21 апреля 2007 года начались продажи. Выпуск модели с кузовом хетчбэк начался в феврале 2008 года. Модификацию с кузовом универсал показали на автосалоне в Краснодаре в октябре 2008 года, а производство варианта с этим кузовом началось 27 мая 2009 года.

Кроме этого, ВАЗ выпускает малыми сериями модификацию «купе» (фирменное обозначение трёхдверного хетчбэка) и вело разработку кабриолета на его базе.

С начала 2009 года семейство «Приора» полностью вытеснило с конвейера семейство «Лада 110».

В 2011 году планируется провести рестайлинг «Приоры». Ожидается обновление дизайна переднего бампера, который будет соответствовать перспективным требованиям по защите пешехода при наезде, новые наружные зеркала с боковым указателем поворота, система идентификации не пристегнутых ремней водителя и переднего пассажира, сетка в багажнике для удержания груза и ряд других опций.

to “Как нарисовать машину Лада Приора”

Здравствуйте администратор, сможете нарисовать ладу x-ray?

нарисуйте пожалуйсто ва 2109

Приора четкая. Спасибо… Но только нарисуй плиз ваз 2101

класс очень красиво. а ВАЗ-2114 сможешь?

я рисовал бугати и додж

клас но я рисую (срисовываю) лучше

рисуеш афигенно но я могу дать пацанам которым лень рисовать поэтапно совет пацаны берете лист формата а4 прикладываете к экрану компьютера с фоткой той машины какую хотите нарисовать и срисоваваете спасибо за приору кстати я ее срисовал своим способом

Мдаааа бедный Андрей, от него столько просят нарисовать всякого. А за приору спс

Приора супер.))) пожалуйста нарисуй Lamborghini

Нарисуй плиз ваз 1117 калину заранее спасибо!

пожалуйста нарисуй бмв 250i это очень любимая моя машина заранее спасибо

нарисуйте пожалуйчта ладу гранту. спасибо заранее

спасибо круто получилось чётко респект=-))))

Приора четкая.большая просьба выложить ваз 2109

Добавте пожалуйста 9 ! приора по кайфу!

от души приорка!! но лучше если была бы тут ваз 2107м clasic2

а в какой программе это рисовать или это рисуется карандашом на бумаге.

Нарисуй ВАЗ — 2107 пожалуйста

Нарисуй Honda Logo ПОЖАЛУЙСТА. ПОЖАЛУЙСТА. ПОЖАЛУЙСТА.

Выглядит как Субари…

нарисовал спасибо большое только у меня лада гранта получилась

прикольно а девятку и 5 бмв с можешь

Сделайте пожайлуста восьмёрку))

Камаз евро2 и Маз можешьнарисовать зарание спасибо

Нарисуй,пожалуйста,бмв или десятку)пожалуйста!приора четкая

Молодец а сможешь нарисовать ниву трёх дверку

Еще в древние времена люди устали ходить на своих двоих и начали приручать различную большую живность для верховой езды. Начиналось все с осла обыкновенного и лошади необыкновенной, но после того, как с глубокого космоса пришло колесо, и человек его приручил – все изменилось. Лошади пошли на колбасу, а колеса брались попарно и вместе с досками различной конфигурации создавались повозки. Сегодня же двинемся намного дальше и узнаем как рисовать Ладу Приору. Лада Приора – трансформер в нерабочем состоянии, выпускаемый ВАЗом, с периодом полураспада не больше одного года. Чаще всего передвигается на четырех колесах, если передвигается вообще. Сначала Лада была задумана как советская радистка-шпион, внедряемая в немецкий тыл, но из-за маленьких госзаказов пришлось переплавлять её на автомобиль, поэтому вид у неё весьма скверный. Чаще всего для экономии кинетической энергии из возможных четырех дверей открывается только водительская, а капот оснащен автоматическим механизмом, который открывается только после поломки двигателя. Внешнее сходство Лады с автомобильным транспортом настолько сильно, что честный русский человек и не задумывается при покупке, а химические составы, выделяемые в салоне, заставляют его любить Ладу и всячески её поощрять. Что можно сделать с Ладой:

Можно превратить транспорт в моноблок с одной дверью сзади. Так вы сэкономите на дверных ручках, боковых стеклах и укрепите корпус;
Если вы холостяк, можно убрать все кресла, кроме водительского. Так вы увеличите пространство внутри автомобиля и сможете перевозить в салоне в 3 раза больше веса, либо одну целую живую корову;
Убрав крышу, вы легко можете превратить вашу Приору в ванну на колесах;
С помощью невидимого шнура вы можете передвигаться даже без бензина, если привяжете автомобиль к другому транспортному средству;
В фильме Трансформеры не использовалась Лада и другие произведения ВАЗа по причине неопределенности принадлежности этого аппарата к транспортным средствам;
В американских фильмах Приора никогда не взорвется, если внутри неё нету медведя в шапке-ушанке.

А сейчас вы сами попробуете нарисовать этот автомобиль карандашом.

Рисуем полицейский автомобиль

Изображение полицейского автомобиля — дело непростое. Для упрощения процесса рисования рекомендуется начать со вспомогательных элементов. Кроме того, для этого рисунка нам потребуется циркуль.

Инструкция:

По центру листа рисуем два прямоугольника, соединённых между собой общей горизонтальной линией. Рисовать мы будем в границах этой фигуры.
Начинаем рисунок с двух прямоугольников
Верхний прямоугольник — это кузов машины. Дугой показываем его форму.
Показываем форму кузова дугой
Добавляем переднюю часть машины — капот.
Дорисовываем линию капота
Мягкой плавной линией соединяем кузов и капот. Вспомогательные линии прямоугольника в этой области стираем.
Соединяем кузов и капот плавной линией
Придаём форму. Изображаем отверстия под колёса, а линию, разделяющую прямоугольники, превращаем в черту, «отделяющую» верх от низа автомобиля.
Слегка наклоняем линию передней части и рисуем выемки под колёса
Добавляем линию багажника, задней подвески, а также черту, отделяющую лобовое стекло от корпуса машины, и две вертикальные линии передней двери.
Добавляем линию багажника и передней двери, а также отделем капот от лобового стекла
Ластиком стираем все лишние линии, оставив только контур самой машины.
Убираем вспомогательные линии
С помощью циркуля делаем колёса.
Рисуем колёса с помощью циркуля
Прорисовываем линии оконных рам, при необходимости используя линейку.
Для изображения окон используем по необходимости линейку
Дополняем колёса окружностями под диски.
Наводим контуры и по желанию раскрашиваем

Видео: как нарисовать полицейскую машину без вспомогательных линий

Фотогалерея: рисуем Bugatti Veyron

Начинаем рисунок с фигуры-основы Делаем линии контура суперкара, а также бампера, бокового обвеса, колёсных арок и капота Изображаем контуры фар, трёх передних воздухозаборника, лобового и бокового стекол, а также линию водительской двери и ещё одного воздухозаборника Детализируем модель: начинаем с сеток передних воздухозаборников, затем переходим к фарам, зеркалам заднего вида, крышке топливного бака, а завершаем колёсами Дорисовываем диски и протектор на колесах, удаляем вспомогательные линии Наводим линии автомобиля

Фотогалерея: как нарисовать кабриолет

Начинаем с наброска контура: верхняя часть имеет овальную форму, а нижняя состоит из прямых линий разного угла наклона Проверяем углы наклона Рисуем передний бампер, правое крыло и скважины для колёс автомобиля Рисуем лобовое стекло, зеркало со стороны пассажира и салон кабриолета Добавляем противотуманные фары и более подробно прорисовываем капот машины, лобовое стекло Прорисовываем боковые двери со стороны пассажиров, контуры заднего бампера, салон машины и сидения для пассажиров, после чего рисуем сложенную крышу машины Дорисовываем колёса Прорисовываем диски на колёсах машины, обращая внимание на симметричность спиц, убираем вспомогательные линии Наводим контуры и по желанию раскрашиваем автомобиль

АвтоВАЗ приступил к предсерийной сборке обновленного Lada Largus

Lada Largus 2021: 5 важных (и нужных) обновлений

Модернизированный мотор, новый интерьер, улучшенная шумоизоляция, дополнительные опции… — рестайлинг не только освежил Ларгус, но и исправил многие н …

14 «фишек» обновленного Jaguar F-Pace Это красивая машина – видно же на картинках. Но красота должна быть и внутри – в машине масса интересных и элегантных инженерных решений. …

Lada Granta станет мощнее Lada Granta обзаведется модернизированным 8-клапанным двигателем объемом 1,6 литра, который дебютировал на обновленном Lada Largus: в результате дора …

Обновленную Lada Vesta сняли на видео В Сургуте сняли на видео дорожные испытания пары обновленных Lada Vesta, а именно седана и универсала Vesta SW Cross. Ранее предсерийные машины накат …

Новые Lada станут дешевле на 20 процентов Компания «АвтоВАЗ» объявила о завершении очередного этапа модернизации производственных линий. Специалистам компании удалось значительно перестроить …

Lada Niva Travel — очень подробный тест Равнодушных к машине за время тест-драйва я не встретил. Love it or hate it. Любить или ненавидеть. Даже в Тольятти на машину оборачиваются, но многи …

Италия отменила киноцензуру Власти Италии отменили цензуру на кинофильмы. Речь идет о моральных и религиозных аспектах. Фильмы будут маркированы по возрастной аудитории. Об этом …

Сегодня Apple изменила условия гарантии и начала принимать по гарантии iPhone 12 из других стран, но, к сожалению, не из всех. …

Пол Джордж высказался о Кармело Энтони Атакующий защитник «Лос-Анджелес Клипперс» Пол Джордж поделился мнением о лёгком форварде «Портленд Трэйл Блэйзерс» Кармело Энтони. Джордж отдал долж …

Ленский из Михайловского 15 апреля у всех поклонников оперы есть прекрасная возможность насладиться чарующими мелодиями оперы П.И. Чайковского «Евгений Онегин», которая по пр …

Раскрыт секрет Xiaomi Mi 11 Ultra Xiaomi использовала дисплей от фитнес-трекера Mi Band 5 в своем новом флагманском смартфоне. Об этом сообщает китайское издание ITHome. …

Оценка Patreon увеличилась до $4 млрд Сервис для пожертвований Patreon привлёк $155 млн в рамках нового раунда финансирования. По итогам оценка компании увеличилась втрое, до $4 млрд.Об у …

Китай построит пятый космодром В Китае в уезде Сяншань восточной провинции Чжэцзян планируется построить пятый в стране космодром. Об этом сообщает «Интерфакс» со ссылкой на сайт з …

Как рисовать каляки-маляки — Образ жизни — Новости Санкт-Петербурга

Эрве Тюлле/Фото автораПоделиться

Эрве Тюлле — знаменитый детский автор и иллюстратор из Франции. Он умеет играть с детьми. А уж когда дети читают его книги, они могут и кричать, и петь. Книги эти из толстой бумаги, и их можно – и даже нужно — трясти и читать хоть 50 раз. Если это раскраски, то их не педантично раскрашивают, а творят в них. Как создавать креативные каляки-маляки, Эрве показал на мастер-классе в Петербурге за день до зимы, а «Фонтанке» рассказал о своем подходе к творчеству.

…Иногда Эрве включает громкую музыку и не глядя берет карандаш. Так и рисует. Иногда даже не глядя на бумагу. Обладатель премии Международной книжной ярмарки в итальянском городе Болонья, уроженец Нормандии Эрве Тюлле эмоционален, артистичен, раскрепощен и умеет общаться при помощи звуков и жестов. Он непосредственен, как дети, с которыми постоянно общается.

ПоделитьсяПоделитьсяПоделитьсяПоделитьсяПоделиться

На своих мастер-классах он быстро рисует каракули и спрашивает, нравится ли это детям. Те дружно отвечают «у-у-у», что, вероятно, означает «пардон, но не очень-то нам это все нравится, месье, мы и сами так умеем». И тогда он спрашивает, а есть ли желающие присоединиться к нему. Желающие тут же находятся, и он предлагает погоняться маленькому художнику карандашом за его каракулями, а потом гоняется карандашом за каракулями ребенка. Детям – весело. А из каракулей рождаются образы.

А еще можно изобразить разноцветные три глаза, шесть рук и еще со всех сторон ноги. На основе такого подхода, объясняет Эрве, можно создать детскую ролевую игру или книгу. Он признается, что хотел бы, чтобы его книги подвигали к творчеству не только детей, но и взрослых. Взрослые, которых собралось на вечернюю встречу в «Буквоеде» с Эрве куда больше, чем детей, эту идею поддержали и весьма успешно по просьбе Эрве изображали звуками дорожную пробку.

Такие игры — это и хороший актерский тренинг по интонации. Эрве показывает нам бабочку и просит выразить интонацией свое отношение к ней. С каждой следующей страницей книжки бабочка уменьшается или увеличивается. И интонация меняется, выражая отношение к чему-то малюсенькому, среднему или очень большому. Эрве, переворачивая страницы, дирижирует, и с помощью его бабочек или рыбок создается мелодия.

В его книгах можно рисовать, заниматься дизайном, строить целые миры из трафаретов. Книжка может попросить нажать на желтую кнопку-точку. Ты нажимаешь, переворачиваешь, а на следующей странице уже две желтые точки или, например, синяя. Для взрослого — вроде ничего особенного, но детей захватывает, а самые маленькие крохи легко запоминают цвета и счет.

Или вот корова стоит на крутом берегу. Как она переберется на другой? Перейдет по мосточку, ей проложат лесенку, она перелетит? «Для меня интересны и самые необычные, фантастические варианты перемещения коровы», — признается Эрве.

Такие игры дают возможность развить воображение, координацию, наблюдательность. Интерактивные рисовалки и веселилки развивают креативность, абстрактное мышление, чувство цвета, формы, пространства. Автографы, которые раздавал Эрве, тоже были креативные – для каждого читателя он изобразил индивидуальный рисунок.

Эрве Тюлле рассказывает:

— Когда я был студентом, я не хотел заниматься детской книгой, потому что меня заставляли. Вот таким голосом (он демонстирует интонацию сладкого голоса. — Прим. авт.) меня просили ими заниматься, и я, помнится, невзлюбил область детской книги. Но мне очень повезло с моей первой детской книжкой – в ней сформировался мой стиль. Я понял, что родители читали эту книжку и смеялись. И детям нравилось видеть взрослых, читающих эту историю и смеющихся. А история эта о том, как познакомились мама с папой.

По сути, у меня две жизни. В одной я одинок: я один в мастерской, в транспорте, наедине с собой записываю идеи в блокнот. В другой жизни я окружен людьми, преподаю в школах. Причем, когда я иду на занятие, я не знаю, чем конкретно буду заниматься в этот раз. Все основано на интуиции, чувствах, ощущении. И я сам многому учусь в контакте с детьми и учителями. Это общение вызывает настолько глубокие чувства, что заставляет меня творить.

Я не хочу спрашивать, что мы с детьми хотим нарисовать, — мы просто рисуем. Они не знают, что получится. И я не знаю. Я могу собрать две или три тысячи детей, разложить рулоны бумаги, и мы будем рисовать. Я скажу им: «Забудьте, что у вас карандаш. Пусть это будет машина, а вы путешествуете на ней по городу и рисуете улицы, людей, дома». Мне нравится импровизировать и не знать, что получится в итоге. Я всегда боюсь, но мне нравится это чувство. Импровизация дает глубину.

Как я рисую? Включаю громкую музыку, иногда подсвечиваю мольберт с обратной стороны и даже не вижу, что рисую. Рисую, следуя музыке.

Как появляются мои герои, если честно, я тоже не знаю. Это приходит с потоком энергии. Я верю в энергию. Я не верю в рисование как в работу. Мое занятие другого свойства – это такая болезнь, напряжение в приятном смысле слова. Интуиция мне подсказывает, что получится хорошо. Как только появляется идея – хочется ее воплотить. Книги – это как бутылка с посланием, как бумажный кораблик, который плывет к нам. Да, я перфекционист, но не в обычном понимании. Я рисую не методично, рисую быстро. И я сам в общении учусь больше, нежели передаю знаний…

Инга Земзаре, для «Фонтанки.ру»

СОБРАНИЕ ПО ЧЕБУРИАДЕ | Фонд Лада

Доброго Вам морозного денечка)))

Хорошего настроения)))

У нас такие новости –

1- Собираемся в среду в 20-00 23 марта на Савеловской

2- «Дата «Чебуриады» 24 апреля- воскресенье

3- У нас идет процесс приглашения команд , если у Вас есть предложение кого пригласить — сообщайте, пожалуйста))) нужна 1 команда

4- Прошу откликнуться тех, кто может помочь разместить информацию в СМИ об акции(работа на компе)

5- На прошлом собрании набросали идей чем наполнить фойе — пригласить Марьяну Наумову- «русский жим», мастер-класс-по цигун , спортивные танцы , студентов, кто собирали кубик-рубик, цирковую студию, загадки , ребусы детям загадывать, пригласить мастеров йо-йо, или пойи, настрольный теннис, будем делать значки, возможно календарики перекидные, если найдем майки бесплатно, то предложим деткам рисовать/обводить маркерами рисунки и трафареты,

6- Есть вакансии- 7 вожатых ))) аквагриммеры-10, выдача питания-10, спортивные игры в фойе-10, встреча гостей в гардеробе-3, ответственные за раздевалку-3)))

7- Ищем спонсоров для покупки формы деткам, кубков , оплаты поездки в Питер и спортивный инвентарь нужен, как подарки)))

8- Для сбора средств на Чебуриаду нам предоставляют место в ТЦ Тройка на Красносельской, нужна Ваша помощь в четверг 07 апр с 9-00 до 13 -00 или в пятницу 08 апр с 9-00 до 13-00 .

Присутствовать у стенда фонда, и пропагандировать волонтерство и собирать пожертвование в ящичек.

9- Для приезжих команд — из Нижнего и Касимова заказываем гостиницу в Химках и планируем для них 2 интересных для подростков места в Москве. Планетарий закрыт, поведем их на другие экскурсию.

До встречи на собрании в среду 23 марта 2016г. С 20-00 до 22-00.

Для заказа пропуска напишите о своем визите, пожалуйста!

Как освободить автомобиль застрявший в песке

Пляж, копы и застрявший патрульный автомобиль

Jul 25, 2013&nbsp· Зарисовка из жизни ньюйоркских полицейских работающих на пляже. Обычно у них ничего интересного не происходит, а сегодня они умудрились засадить в песок свой патрульный авто. В 99 случаях из 100 они ездят по пляжу на

Полиция Анапы накажет искупавшего внедорожник на пляже

Полицейские обнаружили застрявший в песке автомобиль недалеко от места происшествия. Сотрудники полиции установили личность владельца машины. Сейчас они выясняют, кто был за рулем УАЗа в тот момент, когда он

Машина застряла в песке: топ5 методов выбраться

Но как выбраться с помощью простых подручных средств знают не все. Справиться с неприятной ситуацией помогут пять простых советов от опытных автомобилистов. застрявший в

Можно ли буксировать и раскачивать застрявший в снегу

Можно ли буксировать и раскачивать застрявший в снегу автомобиль с АКПП? Комментарии: 1 09.01.2020 Зимний период является самым суровым испытанием для автомобилистов.

Как вытащить застрявшую машину? Справочник

Содержание1 Как правильно вытащить застрявший автомобиль?1.1 1. Где нас подстерегает опасность (грязь, снег, песок)1.2 2.1 Барахтаемся в грязи1.3 2.2 Выбираемся из снежного плена1.4 2.3 Коварство песка и гравия1.5

Что делать, если застрял в снегу автомобиль?

Застрявший в снегу автомобиль это всегда неприятно, хлопотно и отнимает много энергии. В России это особенно актуально с нашей снежной зимой и долгой весной. В статье приводится ряд шагов, которые помогут Вам

На Днепропетровщине авто утонуло в песке: на помощь

Ранее мы сообщали о том, что в Днепре на пожаре пострадал спасатель. Метки: автомобиль, Вольногорск, ГУ ГСЧС, спасатели

Марсоход &quotСпирит&quot навсегда застрял в песке: Наука и

Перед тем как отправить &quotСпирит&quot и &quotОппортьюнити&quot в путешествие длиной свыше 55 миллионов километров (именно

10 практичных советов, как просто и недорого подготовить

Если регион зимой засыпает снегом часто и «от души», стоит возить с собой несколько деревянных досок или старых дорожек и лопату это все поможет освободить застрявший автомобиль.

Как пользоваться штатным телескопическим домкратом LADA

Домкрат винтовой стоечный телескопический (артикул 8450031895) может быть штатным домкратом на автомобилях Lada Vesta, Granta, Kalina, Priora и Datsun. Он пластмассовый (оба его винта сделаны из пластмассы), чтобы не сломать его или не

Если машина застряла в снегу?

Если ваша машина застряла в снегу Сегодняшняя статья, думаем, заинтересует каждого водителя. Ведь при обучении вождению такому не учат, но знать это должен каждый! Мы поговорим о том, как выехать из снежного плена

Куда звонить, если машина застряла в грязи, снегу или песке?

Чтобы успешно вытащить автомобиль, недостаточно иметь в багажнике буксирный трос, нужно еще и найти подходящий для выполнения такой работы автомобиль. Как минимум это должен быть джип, еще

Можно ли буксировать и раскачивать застрявший в снегу

Зимний период является самым суровым испытанием для автомобилистов. Конечно зимние покрышки несколько сглаживают ситуацию, однако попадание в снежный плен вынуждает водителя прибегать к различным хитростям, чтобы

На одесском Ланжероне вытаскивали из песка застрявший

На одесском Ланжероне вытаскивали из песка застрявший автомобиль. нарушителю отправились джиперы клуба ڲх4» и вытащили увязнувший в песке автомобиль. Помню как в начале 90х там КамАЗ

На Николаевщине две легковушки и пассажирский автобус

Для оказания помощи привлекались спасатели 7й ГПСЧ. В данных случаях никто из людей не пострадал. Напомним, как на Черкасчине автомобиль посла Канады застрял на бездорожье.

Как не застрять на автомобиле в песке — и выбраться, если

Лето и море — хороший повод сесть в автомобиль и отправиться на ближайший пляж. К сожалению, многие водители не понимают всей коварности побережья. Помимо красивых видов и приятной атмосферы, поездка на пляж может

Как вытащить застрявшую машину из грязи, снега, песка в

Как вытащить машину из грязи. Где бы вы ни застряли, для того чтобы удачно освободиться – вам не нужно буксовать, иначе вы погрязните еще больше, и выбраться будет уже гораздо сложнее.

&quotСпирит&quot навсегда застрял в марсианских песках

Даже на Земле вытащить застрявший в песке автомобиль бывает непросто. На Марсе, когда до конца неясно, как именно завяз аппарат и каковы свойства окружающего грунта,

Что делать если застрял автомобиль? — Автомобильный портал

Если вы застряли в песке, то есть возможность снижения давления в шинах, прокопать небольшой свободный путь перед колесами и сложить на него веточки, траву, камни.

Что значит таможенник Значения слов

Шериф, вызванный после таможенника, показал, что он нашел автомобиль, застрявший в песке, и что на его переднем сиденье лежала ампула со снотворным.

В Рождество спасатели вытягивали ВАЗ, застрявший на пляже

Позже, в 13:00 ЧП произошло в с. Шевченко Приазовского района. Там спасатели вытащили из снежного заноса легковой автомобиль ВАЗ, водитель которого съехал в кювет и не мог самостоятельно

Застряла машина куда звонить Автомастер

При попытке освободить застрявший транспорт, прикрепив к нему трос, затем резко дернув, часто страдает рулевое управление, выходит из строя бортовой компьютер. если она застряла в песке

В Актау на побережье 1 микрорайона застрял военный КамАЗ

Застрявший в песке автомобиль пытались вытянуть буксировочным тросом, пристегнутым к другому КамАЗу. Шел по морю и увидел, как один КамАЗ

Как правильно вытащить застрявший автомобиль?

Перед тем как прицепить лебедку к автомобилю, необходимо точно определить направление, в котором вы должны вытягивать транспорт, так как если тянуть автомобиль в неправильном направлении, он может сесть еще глубже.

Люди подтолкнули застрявший трамвай голыми руками КТК

Люди подтолкнули застрявший трамвай голыми руками В Великобритании нескольких людей попросили толкнуть трамвай, чтобы освободить его, сообщает Sky News. так как

Как вытащить застрявший автомобиль: основные

Как вытащить застрявший автомобиль: основные действенные приёмы освобождения из песка, снега и грязи. Вытаскивание застрявшего автомобиля — процесс довольно сложный и

1.20 Автоматическая коробка передач Opel Kadett 19841991

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ После запуска двигателя и перед включением передач нажмите тормоз, иначе автомобиль будет «ползти». Не давите одновременно педали акселератора и тормоза. На положении «D» можно ездить

Как вытащить застрявший автомобиль Авто Mail.ru

Как вытащить застрявший автомобиль Даже опытный «джипер» не застрахован от того, чтобы застрять в паре метров от цивилизации

фотографий старых инструментов установки Fender Fret? | Стр. 2

Хорошо, вот снимок картины из книги Уиллера.

Как я уже сказал, не так много видимых фактов реальной системы, только задняя сторона человека, управляющего ею.

Для удаления вот несколько не очень хороших снимков одного из тех, что я сделал недавно. Я начинаю с того, что надеваю простой защитный кожух, который я сделал, чтобы защитить шею от любых возможных скольжений на первых шагах. Затем я вырезал небольшую ямочку до конца резаком Foredom.

Вот конец лада с заточенным пазом, чтобы принять удар и удерживать его в центре.

Затем я вхожу с перфоратором, кончик которого отшлифован, чтобы он точно соответствовал выемке, и начинаю выдвигать низкие частоты на высокие частоты легкими ударами молотка. Сила должна быть направлена как можно ближе к ладу, с достаточным углом вниз, чтобы удар оставался на месте и не отрывался от края выемки, при этом прикладывая как можно меньшее давление к доске, чтобы не сжимать лад. вниз в лес.

Вот он начинает выходить с другой стороны —

Как только он начнет скользить, вы можете схватить его с другой стороны кусачками и вытащить до конца.

Эта фотография была на самом деле плохой техникой, и не то, как я ее на самом деле тяну, а скорее бездумным позированием для камеры (хотя я смог найти только одну, чтобы начать рисовать). На самом деле лучше взять кусачки одной рукой, а затем, положив руку на доску, медленно оттолкнуть кусачки большим пальцем.Это дает гораздо больший контроль над направлением, в котором вы натягиваете лад, и снижает риск его вылета после того, как он начнет двигаться, если вы попытаетесь тянуть от руки, как на фото.

Часто меняйте положение кусачков, чтобы всегда вытягивать их по радиусу, а не просто оттягивать от доски. Когда вы дойдете до самого конца, вам действительно нужно замедлить темп и убедиться, что лад уходит ровно и гладко. Выходите слишком быстро, и может быть трудно удержать его на одной линии с прорезью и радиусом, и это легко может привести к сколам на краю доски.Вот фото получше, как вытащить лад в самом конце удаления.

Вот удаленный лад —

А вот снимок поверхности под ним.

Этот пример был взят из Tele середины 50-х, и отделка была настолько тонкой и состаренной, что ее можно было сделать практически без сколов, а поскольку плата была хорошей и прямой, можно было просто установить новые лады соответствующей ширины прямо сверху без каких-либо доработок.

На толстой шейке 70-х годов или такой, которая потребует любого выравнивания доски, конечно, работа может быть намного менее простой.

Создание бесплатных диаграмм для гитары онлайн

Панель управления

Настройки грифа

В этой панели вы можете установить размер, стили и количество ладов грифа.

Число ладов

Этот ползунок изменяет количество ладов грифа.
Вы можете свободно установить этот параметр при редактировании гитарных диаграмм, точки не будут удалены.

Номер строки

Этот ползунок изменяет количество струн на грифе.
Вы можете установить этот параметр на 4 или 5 для диаграмм низких частот или даже ниже.

Вы можете свободно установить этот параметр при редактировании гитарных диаграмм, точки не будут удалены.

Ширина / высота ладов

Этот ползунок изменяет размер ладов.
Вам может понадобиться этот большой размер для диаграмм с небольшим количеством ладов или меньший для больших диаграмм.
Также вы можете установить большое значение, если вам нужно сгенерированное изображение большего размера.
Вы можете свободно установить этот параметр при редактировании гитарной диаграммы.

Ширина / высота ладов

Изменить тюнинг

Установите количество струн и настройку.

Значения по умолчанию для 6-струнной гитары, если вы играете на стандартной 7-, 8- или 9-струнной гитаре, вам просто нужно изменить количество струн.
Если вы играете на других струнных инструментах, вы можете установить количество струн до 12 и работать с ползунками в соответствии со своей настройкой. (Правильная настройка необходима только для отображения правильных названий нот и интервалов)

Ползунки настройки

Настройте каждую струну отдельно с помощью соответствующего ползунка.
Вы увидите столько ползунков, сколько строк вы установили.

Цветная панель

Выберите цвет точек и установите собственный текст.

Цвета

Выберите цвет, затем щелкните на грифе, точки будут иметь цвет, который вы выбрали.
Последний квадрат открывает полную поддон.
Чтобы изменить цвет точки, выберите другой цвет и щелкните по нему.

Разделение цветов в настоящее время не поддерживается Firefox.

Пользовательский текст

Если вам нужно писать заметки или интервалы, просто активируйте функцию автоматической записи.
.
Текст, содержащийся в этом поле, появится в точках и заменит автоматическое обозначение.
Удалите текст, чтобы разместить обычные точки.

Вы даже можете скопировать / вставить некоторые причудливые символы, например: ♠ ♣ ♥ ♠.

Слои

Вы можете редактировать 2 слоя на одном грифе. Слой 2 имеет квадратные точки.

Например, вы можете написать / сгенерировать шкалу с синими квадратными точками на слое 2 и арпеджио с желтыми круглыми точками на слое 1, а затем визуализировать их вместе и по отдельности.

Запись по всем октавам одновременно

Классная функция для написания арпеджио, гамм и аккордов на шее на одном дыхании.

Вы просто нажимаете на ноту, и будут выбраны все экземпляры во всех октавах.
Например, вы можете отобразить все позиции основных триад A на всем грифе с помощью всего 3 щелчков мышью, на A, C # и E.

Также вы можете использовать его для изменения цвета всех экземпляров определенной степени на вашей диаграмме .

Скачать как изображение

Нажмите эту кнопку, чтобы создать версию диаграммы грифа в формате .PNG. Затем нажмите на появившуюся кнопку загрузки, чтобы немедленно начать бесплатную загрузку диаграммы грифа.

Регистрация не требуется, изображения можно использовать бесплатно для любых целей.

(Если вы чувствуете, что хотите ответить взаимностью, поделитесь этой страницей: D)

Панель обозначений

Автоматически отображать названия заметок или интервалы внутри точек.

Если вы использовали пользовательский текст, это переопределит эту функцию.

Отображаемое имя заметки

Покажите названия нот на грифе.Выбранные лады будут иметь название ноты в точке.
Если вы используете собственный текст, он заменит имя заметки.

Имя интервала отображения

Покажите названия степеней на грифе, начиная с основной ноты.
Для выбора корня используйте селектор корня.

Выбранные лады будут иметь название степени в точке.
Если вы используете произвольный текст, он заменит название степени.

Название ноты FLAT / SHARP Selector

В определенных ситуациях вы можете предпочесть не называть «A #» и «Bb», поэтому просто нажимайте на эти квадраты для переключения между энгармоническими эквивалентными названиями нот.

Название степени Селектор FLAT / SHARP

Что касается названий нот, вы не должны называть «# 4» и «b5», поэтому просто нажимайте на эти квадраты для переключения между энгармоническими эквивалентными названиями интервалов.

Если вы чувствуете, что вам действительно нужно что-то необычное, например «bb3» или подобное, вы можете использовать собственный текст.

Селектор корня

Интервалы начинаются с 1 градуса: чтобы выбрать его, активируйте эту функцию, затем щелкните по корневому ладу.

UNDO

Вы можете отменить три последних действия: Возможно, вы по ошибке нажали кнопку «Сброс»: нажмите здесь, спасибо позже!

СБРОС

ВНИМАНИЕ: Это уничтожит все!

ИНДИКАТОРЫ FRET

Скройте маркеры, если ваш инструмент отличается, или если вы пишете форму, которую не хотите визуализировать на определенном ладу.

КРЫШКА ПЕРЕДНЕГО БОРТА

Добавьте подпись к вашей диаграмме, она также появится на сгенерированном изображении.

Удалить слой 1

Удаляет все точки на первом слое.

Удалить слой 2

Удаляет все точки на втором слое.

Гриф

Щелкните лад, чтобы поставить точку, щелкните еще раз, чтобы удалить ее.
Щелкните заголовок и описание, чтобы отредактировать их.

Скрыть инструкцию

Щелкните, чтобы закрыть эту панель.

Стиль грифа

Щелкните, чтобы изменить цвет грифа и струн.

GENERATE Весы

Эта функция позволяет автоматически создавать диаграммы весов.
Введите структуру шкалы, используя раскрывающийся список, или выберите каждый интервал для настраиваемой структуры, затем нажмите «Создать шкалу».
Для удаления сгенерированных чешуек используйте кнопки «стереть слой 1/2».
Обратите внимание, что функция будет генерировать масштаб на выбранном слое, начиная с текущего корня, поэтому убедитесь, что выбрали правую корневую ноту и правильный слой.

Pro Совет: например, вы можете использовать эту функцию для создания синей шкалы на слое 2, а затем желтой триады на слое 1, чтобы визуализировать их вместе.

Скоро будет добавлен более обширный список типов весов

ТРАНСПОРТЕР

Эта функция позволяет транспонировать ваши заметки.
Щелкните транспонировать вверх / вниз, чтобы транспонировать все ноты на текущем слое, щелкните на выбранных точках, чтобы транспонировать только некоторые точки.
Не забудьте отключить селектор, чтобы снова отредактировать гриф

СОХРАНИТЬ И / ИЛИ ПОДЕЛИТЬСЯ

Эта функция позволяет хранить гриф онлайн.
Вы можете оставить ссылку себе или поделиться ею с кем угодно.

Это абсолютно БЕСПЛАТНО и не требует регистрации.
(Если вы чувствуете, что хотите что-то сделать для поддержки проекта, расскажите своим друзьям о GuitarScientist.com)

ПЛОЩАДКИ

Активируйте режим квадратов, затем нажмите кнопку «добавить квадрат», чтобы добавить цветной квадрат на гриф.
Вы можете перетаскивать квадраты и изменять их размер, чтобы выделить некоторые области грифа.
Не забудьте выключить режим квадратов, чтобы снова отредактировать точки.

НОВЫЙ БОРТ

Щелкните по логотипу на новом пустом грифе.

ЗАГРУЗИТЬ НЕДАВНУЮ ЭКОНОМИЮ

Если вы сохранили какие-то документы, вы найдете их здесь

ВЫБРАННЫЙ ПЕРЕДНИЙ БОРТ

Это гриф, над которым вы работаете, здесь будут действовать автоматические генерации, такие как сгенерированные гаммы или транспозиции.
Вы можете выбрать гриф, щелкнув этот карандаш или вручную расставив на нем точки.

КОПИРОВОЧНЫЙ БОРТ

Нажмите на значок копирования, затем на другой гриф, и содержимое первого будет скопировано на гриф назначения.

ПЕРЕМЕЩЕНИЕ ОТДЕЛА

Используйте эту ручку, чтобы перетащить и переупорядочить грифы

СТЕРЕТЬ ПЕРЕДНИЙ БОРТ

Эта накладка удаляет ВСЕ содержимое этого единственного грифа.

Как рисовать ЭМИНГЛ и АМБЛЕР «Узоры клубочков.com

Линда Фармер, CZT ~ 31 июля 2010 г.

Emingle представляет собой повторение одной из старейших классических форм дизайна, известной как лад . Этот узор является одним из оригинальных узоров Zentangle®, предложенных создателями Риком Робертсом и Марией Томас.

Я нашел Emingle в книге Сэнди Бартоломью, AlphaTangle . В настоящее время нет онлайн-инструкций по рисованию Emingle , но это простой шаблон для расшифровки.

Сначала я нарисовал основную сетку, затем заполнил получившиеся квадраты ладовой формой — каждый из них использовал одну и ту же начальную точку в верхнем левом углу. Вы можете изменить это, сделав вашу сетку изогнутой и / или нерегулярной, и в итоге вы получите различные размеры и формы ладов. Рисовать это действительно забавный наполнитель. Вы можете затемнить центры, чтобы сделать изображение более трехмерным.

Оригинальный Zentangle® вариант Emingle , названный Ambler , представляет собой версию «вне сетки», использующую форму ладов в перекрывающихся лентах, нарисованных с использованием техники рисования сзади Hollibaugh .

Согласно Кларенсу П. Хорнунгу в его Справочнике по конструкциям и устройствам ,

Лад, или меандр, представляет собой плоский прямоугольный мотив, заимствованный из древнегреческого орнамента. В некоторых случаях это также известно как ключевой рисунок… рисунки ладов являются угловыми или прямоугольными аналогами спирали.

Ознакомьтесь с тегом zentangle , чтобы узнать больше о заплетениях из оригинальной Zentangle® на TanglePatterns.com.

Ссылки по теме

Ищете путаницу по исполнителю или типу? Для получения более подробной информации посетите страницу «О НАС»> «КАК НАЙТИ ПУТЛЕТЫ ПО ХУДОЖНИКУ ИЛИ ТИПУ» в верхней строке меню любой страницы сайта.
Что такое дзентангл? — если вы новичок в методе Zentangle, начните здесь, чтобы познакомиться с основами
Терминология Zentangle — глоссарий терминов, используемых в этой художественной форме
Линды оригинальных узоров в технике дзентангл — вот полный список оригинальных переплетений ( или «официальных переплетений»), созданных и представленных основателями Риком Робертсом и Марией Томас, включая те, которые не опубликованы в Интернете. Если вы новичок в методе Zentangle, я настоятельно рекомендую сначала изучить несколько опубликованных классических работ по Zentangle.
Узор — это не всегда клубок — вот из чего получается клубок.
Как отправить деконструкцию вашего паттерна в TanglePatterns
Чтобы получить множество отличных БЕСПЛАТНЫХ уроков по TanglePatterns, нажмите ссылку Учебники в розовой строке меню под буквами изображений в верхней части любой страницы.
струн! У нас есть СТРУНЫ! Щелкните ссылку СТРОКИ в розовой алфавитной строке меню под изображениями клубков в верхней части любой страницы для 250 различных (бесплатных) Zentangle-startters.Более чем достаточно на любую жизнь!

.oOo.
Расширьте возможности Zentangle, поддерживая паттерны TanglePatterns:
НОВИНКА! ! TanglePatterns.com ПУТЕВОДИТЕЛЬ ТАНГЛЕТОВ, выпуск 2021 года
	10-е издание паттернов TanglePatterns .com TANGLE GUIDE — это мгновенная загрузка 90-страничная интерактивная электронная электронная книга , содержащая 1500+ клубков на сайте с мая 2010 по 31 декабря 2020 . Это отличный ресурс и необходимый цифровой инструмент для использования сайта. Посетите страницу МАГАЗИН> ЭЛЕКТРОННЫЕ КНИГИ и помогите поддерживать TanglePatterns.com в сети, получив свою копию прямо сейчас!
	« Линда, Спасибо! Я полагалась на слишком мало и застревала после 3 лет ежедневной работы с Zentangle.Это вдохновило меня «начать заново» с новым волнением. «~ Барбара Р.
См. Страницу ОБЗОРЫ КНИГИ, чтобы получить более подробную информацию о ее функциях и просмотреть образец страницы. Примечание: это цифровой продукт, который вы загружаете при размещении заказа, физически вам ничего не будет отправлено по почте.
ЗАКАЗЫ ПОДАРОК ДЛЯ ДРУГОГО ЛИЦА: Чтобы подарить TANGLE GUIDE , посетите эту страницу, чтобы разместить свой подарочный заказ.
Если вы новичок в Zentangle® и запутывании, мой TanglePatterns.com РУКОВОДСТВО ПО ZENTANGLE ДЛЯ НАЧИНАЮЩИХ — это именно то, что вам нужно для начала работы. Также доступно на французском и испанском языках.

	Этот — единственная книга Zentangle, которая вам когда-либо понадобится: сказочный Zentangle PRIMER Vol 1. Это ваш CZT-in-a-book от основателей Zentangle ^® . Посетите вкладку МАГАЗИН в верхней строке меню или щелкните изображение. Чтобы узнать больше о содержании и прочитать восторженные обзоры, посетите вкладку КНИГИ ОТЗЫВОВ.
НОВИНКА! Теперь доступен в формате KINDLE по цене 9,99 долларов США.
« Абсолютно лучшая книга Zentangle на сегодняшний день! Как опытный художник, я раньше думал, что мне не нужны инструкции по этому виду искусства. Как я ошибался! После прочтения этой книги мое запутывание улучшилось стремительно. у вас есть Zentangle, тогда эта книга нужна вам как никогда! «~ Kris H

.oOo.

Тренировочные перчатки для спорта и активного отдыха Наклейка на гриф для гитары Наклейка на лад Наклейки на гриф

Наклейка на гриф для грифа на грифе Наклейка на гриф Наклейка на лад Наклейка на гриф Наклейки на гриф, FLT, Наклейка на гриф на грифе Наклейка на гриф Наклейки на гриф, Qewmcg-1, Наклейка на гриф Наклейка на гриф для гитары с картой Наклейка на лад Наклейки с наклейками для гитары Наклейка на гриф с картой Наклейка на лад Наклейки на гриф в тренировочных перчатках.Наклейки на лады карты Наклейки Наклейки для грифа гитары Гриф Примечание.

гитара грифа Примечание карта лад наклейка этикетки наклейки для грифа

Очень подходит для ношения банкнот и монет или двух разных национальных валют, материал отводит пот и очень быстро сохнет, Цветовая температура 3000K соответствует цвету галогенных ламп (мягкий белый), а также является прекрасным дополнением для вашего дома. ** Как минимум 4 отверстия с втулками для легкой установки.Дизайн футболок для мужчин Beautiful Bugle. Саржа из 45% полиэстера с пятнами. Острые нити стягивают материал и обеспечивают надежную фиксацию. Купите женскую рубашку-тунику Lavany больших размеров с длинным рукавом и V-образным вырезом, однотонную блузку для женщин и другую одежду в. Все, что вам нужно, — это ваша совместная помощь. Виллем Геббен делает в своей студии традиционные дровяные керамические изделия и фарфор. tr и sl st и передняя и задняя петли работают. * Гипоаллергенный и легкий материал для украшений для тела, если ваш товар занимает 4 недели или больше, это буклет с рисунками 1998 года с проектами и выкройками, выполненными 30 разными художниками, 99 Royal Mail International Standard, комплекты концов рулевой тяги будут включать два галстука концы стержней и контргайки, эту бахрому можно добавить к костюму.Лучше всего применять при комнатной температуре. Бесплатная доставка и возврат всех подходящих заказов. Две ручки обеспечивают дополнительный захват и позволяют доставить награду прямо перед собакой. Эти солдаты готовы к работе.

Vítejte na stránkách autoservisu a pneuservisu Kosák auto.

Гитара Шейный Гриф Примечание Карта Лада Наклейки Этикетки Наклейки для Гриф

Наклейка на грифе гитары Наклейка на гриф с картой Наклейки на гриф Наклейки для накладки на гриф, тренировочные перчатки — Канада.Гриф гитары Примечание Карта Наклейка на лад Этикетки Наклейки для накладки на гриф в тренировочных перчатках .. 6- Для 6-струнной акустики или электрики. ✪- Лучший помощник для новичков. ✪- Инновационная наклейка для нот на грифе поможет вам научиться играть на гитаре и научиться играть на грифе. ✪- После удаления не остается липких следов. ✪- Простота установки и удаления. Особенности:. — Для 6-струнной акустики или электрики. — Лучший помощник для новичков. — Инновационная наклейка для нот на грифе, которая поможет вам изучить гитару и научиться играть на грифе. — Отсутствие липких следов после удаления.- Простота установки и снятия. — Изготовлен из супер износостойкого, сверхпрочного материала. Технические характеристики:. Использование: прослаивание двух ярдов до середины отверстия. Цвет: Многоцветный. Размер одной наклейки: 20 * 15 * 1 мм. Упаковка В комплекте: .1 наклейка для примечания на грифе. Примечания:. Из-за разницы между различными мониторами изображение может не отражать фактический цвет элемента. Мы гарантируем, что стиль такой же, как показано на изображениях. . . .

Гитара Шейный Гриф Примечание Карта Лада Наклейки Этикетки Наклейки для Гриф

гитара грифа Примечание карта лад наклейка наклейки наклейки для грифа

Fityle Силиконовый мундштук для плавания, подводного плавания и подводного плавания с аквалангом на сухом воздухе для детей Kids.Bellelli Pulcino Велосипедное детское сиденье Детское кресло-переноска для велосипедов Крепление на передней вилке Сделано в Италии Супер и супер безопасно для вашего ребенка, Homyl Уличные аксессуары для палаток для кемпинга Компрессионная сумка для хранения в рулоне. Jandukar Мужские классические рубашки с длинным рукавом в стиле пэчворк с воротником-стойкой. FBSL Браслет Синий тигровый глаз Браслеты Будды Натуральный камень Круглые бусины Эластичность Веревка Мужчины Женщины Браслет. VT809 Giottos 6E01 Запасная быстросъемная пластина для VT806 и MV825 Monopod VT808. Водонепроницаемая силиконовая шапочка для плавания Dolphin, шапочка для плавания для взрослых, мужчин, женщин, синяя, с заклепками, графическая подушка в стиле середины века, 17 x 17 дюймов, черно-зеленая, рули для велосипеда, комплект аэродинамических рулей, включая установочные фитинги с губчатой подушкой для гонок на велосипеде на длинные дистанции, 14 предметов Sunex 2644 Набор универсальных ударных головок SAE для привода 1/2 дюйма.Теплодержатели Twist Crew Sock. Изолятор топливного фильтра для Honda EG1400X Generator Panari Carburetor.ScubaMax SV-05 Обычный жилет для подводного плавания для взрослых. Женские танцевальные кроссовки с разрезной подошвой Bloch Dance Canvas Boost, сверхлегкий шлем Edelrid, серебристый 3 ED, перевозка 50 упаковок сверхмощных D-образных вешалок для картин с винтами с двойными отверстиями PH. Женская майка с логотипом Twist It PUMA. Fastway 86-00-3660 Dual Pin Lock Set, Усилитель захвата руки с регулируемым сопротивлением 10-40KG Тренажер для тренировки силы запястья пальца Нескользящий захват Соковыжималка для рук Тренировка для рук Тренировочное оборудование для реабилитации спортсменов Музыкантов, Zero Hour The Lost Files I Am Number Four, Джонни Коттон Барабаны Барабанщик Универсальная футболка Мужская и женская Фестивальная группа музыкальных инструментов.Лайонел Рейсинг Кевин Харвик # 4 Busch Light 2018 Ford Fusion 1:24 Arc Diecast Car,

гитара грифа Примечание карта лад наклейка этикетки наклейки для грифа

Определение топологии мембраны CLN3 с помощью FRET

Abstract

Ювенильный нейрональный цероид липофусциноз (JNCL) вызывается мутациями в гене CLN3 , который кодирует предполагаемый лизосомный трансмембранный белок с пока не описанными структурой и функцией.Здесь мы исследуем топологию мембраны человеческого белка CLN3 с помощью комбинации передовых методов молекулярного клонирования, спектроскопии и вычисления in silico . Используя метод транспозомного клонирования, мы сначала создали библиотеку клонов кДНК человеческого CLN3 либо со случайно вставленным eGFP, либо с myc-tag, либо с обоими. Функциональность клонов оценивали путем оценки их способности возвращать ранее описанный лизосомный фенотип в иммортализованных гранулярных клетках мозжечка, полученных от мышей Cln3 ^{Δex7 / 8} (Cb Cln3 ^{Δex7 / 8}).Клоны с двойной меткой экспрессировали в клетках HeLa, и измеряли FRET между донорским eGFP и акцептором DyLight547, связанным с моноклональным α-myc-антителом, для оценки их относительной ориентации мембран. Эти данные были использованы вместе с ранее опубликованными экспериментальными данными для составления модели ограниченной мембранной топологии для hCLN3 с использованием алгоритма консенсусного прогнозирования мембран TOPCONS. Наша модель с шестью трансмембранными доменами и цитозольными N- и C-концами в значительной степени согласуется с ранее предложенными, но отличается в терминах положений трансмембранных доменов, а также в размере люминальных петель.Это открытие улучшает понимание функции нативного белка hCLN3.

Образец цитирования: Ратайчак Э., Петчерски А., Рамос-Морено Дж., Руонала М. О. (2014) Определение топологии мембраны CLN3 с помощью FRET. PLoS ONE 9 (7): e102593. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0102593

Редактор: Педро Фернандес-Фунес, Университет Флориды, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 13 декабря 2012 г .; Одобрена: 19 июня 2014 г .; Опубликован: 22 июля 2014 г.

Авторские права: © 2014 Ratajczak et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: E.R., A.P., J.R.M. и M.R. были поддержаны Фондом исследований JNCL, Оулу, Финляндия. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Цероидный липофусциноз нейронов (NCL, или болезнь Баттена) относится к группе летальных педиатрических нейродегенеративных заболеваний, возникающих в результате мутаций в одном из до сих пор идентифицированных 13 генов CLN (цероидный липофусциноз, нейрональный тип; от CLN1 до CLN14) [ 1]. Возраст начала NCL варьируется между различными формами NCL, но обычно он диагностируется в младенчестве или раннем детстве и заканчивается преждевременной смертью [2]. Физиологические особенности, общие для большинства форм NCL, включают потерю зрения, снижение моторики и когнитивных функций, а также прогрессирующее появление аутофлуоресцентных лизосомных накопительных телец, обогащенных субъединицей c митохондриальной АТФ-синтазы и белками-активаторами сфинголипидов [3] — [7].Клетки центральной нервной системы (ЦНС) в первую очередь уязвимы для всех форм NCL. Тем не менее, недавно сообщенные сердечные нарушения на мышиной модели ювенильной формы NCL (JNCL) также предполагают системные ответы вне ЦНС [8] — [11].

JNCL вызывается мутациями в гене, кодирующем белок CLN3, наиболее распространенной мутацией у людей является делеция 1,02 т.п.н., которая устраняет экзоны 7 и 8 и кодирует усеченный белок CLN3 [12]. CLN3 — это высокогидрофобный многомембранный белок с предполагаемой лизосомной и эндосомальной локализацией.Данные пациентов и различных моделей JNCL косвенно подтверждают роль CLN3 в переносе мембран, эндоцитозе и аутофагии, среди прочего, а также в регуляции лизосомного pH и транспорта аргинина [4], [13] — [16]. Однако из-за отсутствия надежных инструментов точная функция и местоположение CLN3 остаются неясными. Из-за крайней гидрофобности и межвидовой консервации создание высокоточных антител против CLN3 с помощью традиционной иммунизации оказалось затруднительным [17].Также неясно, доступны ли эпитопы, используемые для генерации пептид-специфических антител в интактной клеточной среде [18]. В какой степени поведение эктопически экспрессируемого слитого белка CLN3 имитирует поведение эндогенного CLN3, сказать невозможно. Однако более ранняя работа показала, что эктопическая экспрессия полноразмерного человеческого белка CLN3 (hCLN3) способна спасти вакуолярный фенотип в модели Δ-нокаута Btn1 S. cerevisiae, лишенной дрожжевого ортолога CLN3 [19], [19] [ 20].Это демонстрирует, что эктопическая экспрессия модифицированного белка CLN3 в действующей модели JNCL может использоваться для проверки его функциональности. В этом исследовании мы использовали это наблюдение и использовали ранее описанный лизосомный фенотип в гранулярных клетках мозжечка для тестирования модифицированных белков CLN3 на их способность реверсировать этот фенотип [13]. Эта генетически точная модель культуры клеток млекопитающих состоит из иммортализованных гранулярных клеток мозжечка, полученных от мышей CD1- Cln3 ^{Δex7 / 8}, гомозиготных по наиболее распространенному человеческому Cln3 1.Делеция 02 kb (Cb Cln3 ^{Δex7 / 8}) [14]

Точная структура CLN3 может быть восстановлена только с использованием методов высокого разрешения, таких как 3D крио-ЭМ или рентгеновская кристаллография [18], [21] — [23]. Эти методы требуют значительных количеств правильно свернутого чистого белка CLN3 в адекватной среде. К сожалению, в значительной степени из-за отсутствия надлежащих биохимических инструментов попытки выделить достаточное количество CLN3 из клеток и тканей или его производство с использованием методов in vitro не увенчались успехом.На данный момент модель, объединяющая ограниченный объем экспериментальных данных и дополненная прогнозами in silico, остается общепризнанным структурным состоянием в данной области техники. Эта модель описывает CLN3 как многомембранный охватывающий белок с шестью трансмембранными доменами (TMDs), с N- и C-концами, обращенными к цитозолю [17], [24], [25]).

В этой работе мы экспериментально исследовали топологию мембраны меченого белка hCLN3 с помощью микроскопии с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET).Сначала с использованием метода клонирования транспозазы была создана библиотека из 11 клонов hCLN3 либо с одной вставленной внутри eGFP или myc-тегом, либо с eGFP, близким к C-концевому, и одним myc-тегом по направлению к N-концу. Функциональность клонов оценивали по степени их нацеливания на лизосомы и их способности восстанавливать конкретный лизосомный фенотип в клеточной линии Cb Cln3 ^{Δex7 / 8}. Клоны hCLN3 с двойной меткой временно трансфицировали в клетки HeLa и метили конъюгированным с DyLight-547 антителом α-myc.Эффективность FRET между донором eGFP и акцептором DyLight547 определяли с помощью флуоресцентной микроскопии с визуализацией времени жизни (FLIM) и использовали для оценки их относительной ориентации мембран. Данные FRET использовались в алгоритме прогнозирования мембран TOPCONS вместе с другими доступными экспериментальными данными, чтобы служить в качестве ограничений для расчета новой топологии мембраны hCLN3. Уточненная модель для hCLN3 согласуется с большинством имеющихся экспериментальных данных, но отличается от ранее предложенных моделей с точки зрения положения TMD и длины цитозольных и люминальных петель.Наша модель обеспечивает новые интригующие аспекты понимания патологических механизмов JNCL.

Результаты

Создание и оценка клонов hCLN3 с внутренней меткой

Библиотека клонов кДНК человека CLN3 с транспозоном с усиленным зеленым флуоресцентным белком и кассетой устойчивости к канамицину была создана с использованием метода транспозомного клонирования с использованием плазмиды pCMV5 с кДНК CLN3 человека в качестве вектора-мишени. Полученные клоны исследовали в трехэтапном процессе для идентификации вариантов кДНК pCMV5-hCLN3 с транспозоном в последовательности hCLN3 в правильной ориентации и в рамке считывания (см. Mat & Met) [26].После удаления кассеты для отбора канамицина из клонов с успешно вставленным транспозоном сайты вставки были идентифицированы путем секвенирования (таблица 1). Полученные плазмиды кодируют hCLN3 с внутренним eGFP, фланкированным пептидами из 9 и 12 аминокислот [26], [27]. Чтобы создать инструменты для внутримолекулярных исследований FRET, мы затем заменили фрагмент eGFP в первых десяти клонах hCLN3-eGFP на эпитоп myc (MEQKLISEED), сохранив при этом исходные сайты встраивания и фланкирующие пептидные последовательности.Впоследствии, используя метод гибридной ПЦР, мы создали химерные клоны hCLN3-eGFP-myc, комбинируя myc-содержащую N-концевую половину из десяти клонов hCLN3-myc с C-концевой половиной hCLN3-eGFP11, содержащей eGFP. Стоит упомянуть, что девять нуклеотидных повторов, фланкирующих каждую из вставок Tn5, образованных ступенчатыми разрезами фермента транспозазы, принадлежат ДНК-мишени (рис. 1А).

Рисунок 1. Получение транспонированных клонов hCLN3.

A: Транспозон, вставленный в кодирующую последовательность человеческого CLN3, продуцирует белок hCLN3 со случайно вставленным eGFP, фланкированным пептидами, изолирующими 9 и 12 аминокислот (подчеркнуты).См. Таблицу 1 для сайтов вставки транспозонов. eGFP в клонах hCLN3-eGFP позже был заменен на myc-tag при сохранении изолирующих пептидных последовательностей. B: Клетки HeLa, трансфицированные клонами hCLN3-myc или –eGFP11-myc, контрастировали с myc-tag и лизосомальным мембранным белком LAMP-1 и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии, и уровень колокализации myc-tag с LAMP-1 был анализировали с использованием независимого от интенсивности алгоритма колокализации (см. Mat & Met). Изображение в правом столбце отражает симметрию интенсивности между myc-tag и LAMP-1.Шкала 10 мкм C: Количественно оценивали уровень экспрессированных клонов hCLN3 в LAMP-1-положительных лизосомах. Добавление eGFP к клонам hCLN3-myc снижает уровень их лизосомальной локализации. Обратите внимание, что последний столбец для химер в C показывает степень совместной локализации hCLN3-eGFP11 без myc-tag N = 2, n> 3. D: Клетки HeLa, экспрессирующие hCLN3-eGFP11 с наибольшим количеством C-концевого eGFP, контрастировали с окрашиванием LysoTracker Red vital dye (LTR) и отображали в реальном времени с помощью конфокального микроскопа при 0.Частота 2 Гц. Показаны кадры из 5-минутной последовательности изображений, иллюстрирующие частичную лизосомную локализацию hCLN3-eGFP11 (верхний ряд). Обычно было замечено, что положительные везикулы hCLN3-eGFP11 сливаются (стрелки в среднем ряду) или диссоциируют (стрелки в нижнем ряду) от LTR-положительных структур. Масштабные линейки 10 и 2 мкм соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0102593.g001

Чтобы исследовать функциональность сгенерированных клонов hCLN3, мы сначала использовали ранее описанное нацеливание на лизосомы в качестве критерия [17], [28], [ 29].Для этого клетки HeLa, временно трансфицированные клонами hCLN3-myc и –eGFP11-myc, подвергали контрастному окрашиванию на myc-tag и лизосомный маркерный белок LAMP-1. Используя алгоритм колокализации, не зависящий от интенсивности, мы обнаружили, что добавление eGFP к клонам hCLN3-myc снижает уровень колокализации. Примерно треть химерных клонов совместно локализованы с положительными структурами LAMP-1 (слияние сигналов, совместная локализация и симметрия сигналов показаны на рисунке 1B, а уровень совместной локализации количественно определен в 1C.См. Подробности в Mat & Met) [30]. Интересно, что большая часть сигнала не колокализуется с лизосомами, что наводит на мысль о динамическом перемещении hCLN3. Для исследования этого клетки HeLa, экспрессирующие hCLN3-eGFP11, совместно окрашивали витальным красителем Lysotracker Red (LTR) и визуализировали вживую с помощью конфокального микроскопа. Покадровые последовательности показали динамическое движение CLN3-eGFP11 в основном в ретроградном направлении от плазматической мембраны (случайный кадр снимка, показанный в верхнем ряду на рисунке 1D; полная последовательность фильма в онлайн-фильме S1).Уровень совместной локализации с LTR постоянно варьировался, и имели место регулярные события слияния и почкования hCLN3-eGFP11 с более крупными LTR-положительными структурами (стрелки в среднем и нижнем ряду на Рисунке 1B, соответственно).

Когда Cb Cln3 ^{Δex7 / 8} клетки выращивают в условиях конфлюэнтности в течение 7 дней (в возрасте), наблюдается накопление автофлуоресцентного лизосомального материала для хранения, а также измененное количество и морфология LTR-положительных структур (стрелки на посеве) 2А) [13], [31].Мы разработали экспериментальную установку для тестирования наших транспонированных клонов hCLN3-eGFP11-myc на функциональность, измеряя их потенциал для восстановления этого фенотипа LTR (рис. 2А). По сравнению с нетрансфицированными старыми клетками Cb Cln3 ^{Δex7 / 8} экспрессия hCLN3-eGFP11 без myc-tag привела к увеличению количества небольших LTR-положительных везикул (рис. 2А). Автоматический анализ изображений показал 1,4-кратное увеличение количества LTR-положительных везикул в трансфицированных клетках и продемонстрировал восстановление фенотипа LTR с помощью правильно сложенного функционального hCLN3-eGFP11 (рис. 2A).Экспрессия hCLN3-eGFP-11 не изменяла количество мелких везикул LTR в старых Cb Cln3 ^{+ / +} зернистых клетках мозжечка (не показаны). Затем мы проверили спасительный потенциал химерных клонов hCLN3-eGFP11-myc. За исключением hCLN3-eGFP11-myc5, все химерные клоны были способны увеличивать количество небольших LTR-положительных везикул в старых клетках Cb Cln3 ^{Δex7 / 8} (рис. 2C). Вместе с данными по нацеливанию на лизосомы этот результат указывает на то, что, за одним исключением, экзогенно экспрессируемые слитые белки с двойной меткой hCLN3, вероятно, будут сворачиваться надлежащим образом, сохраняя по крайней мере частично исходную функцию CLN3 и Структурные исследования на основе FRET.

Рисунок 2. Оценка клонов hCLN3 и анализ FRET.

A: CbCln3 ^{Δex7 / 8 Клетки} выращивали в условиях конфлюэнтности в течение 7 дней для получения автофлуоресцентного запоминающего материала, трансфицированного клонами hCLN3-eGFP11 или hCLN3-eGFP-myc и окрашивали LysoTra с контрастным окрашиванием. Показаны клетки, экспрессирующие hCLN3-eGFP11 вместе с двумя нетрансфицированными клетками. Накопленный в лизосомах материал для хранения указан стрелками на левой панели нижнего ряда.Количество небольших LTR-положительных везикул в клетках с экзогенной экспрессией hCLN3 или без нее (стрелки на увеличенном изображении) количественно определяют в C. Ядра окрашивали DAPI. Масштабные полосы 10 мкм для основных панелей и 3 мкм для обрезанного изображения. B: Клетки HeLa, экспрессирующие либо hCLN3-eGFP11, либо химерные клоны hCLN3-eGFP11-myc (показаны как hCLN3-eGFP11-myc1), фиксировали и окрашивали антителом α-myc, непосредственно конъюгированным с DyLight547. Время жизни флуоресценции донора eGFP в отсутствие (τ _d) или в присутствии акцептора (τ _{d + a}) анализировали с помощью детектора FLIM, построенного на конфокальном микроскопе (см. Mat & Met), и распределение времени жизни в наносекунды показаны псевдо-цветом.Изображения интенсивности донора и акцептора были объединены, чтобы продемонстрировать уровни экспрессии и эффективность микромечения. N = 2, n = 3–8. Масштабная линейка 10 мкм. C: Количественная оценка эффекта восстановления и эффективности FRET клонов hCLN3-eGFP11-myc (черные и белые столбцы соответственно). Небольшие LTR-положительные везикулы в возрасте Cln3 ^{Δex7 / 8} были количественно определены с помощью автоматизированной платформы анализа изображений Cell Profiler и выражены в виде отношения к неэкспрессирующим клеткам.N = 3–5, n> 45. Уменьшение времени жизни флуоресценции eGFP было преобразовано в эффективность FRET и нанесено на график относительно сайта вставки myc-tag в hCLN3. Пороговое значение 8,4% для статистически значимого FRET выделено серым цветом и указано (стрелка).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0102593.g002

Исследование топологии мембраны химер hCLN3 с помощью FRET-FLIM

Вероятность передачи энергии резонанса Фёрстера (FRET) зависит от обратной шестой степени от расстояния донор-акцептор, свойство, которое делает FRET широко используемым методом для исследования молекулярной близости в нанометровом масштабе в интактном клеточном контексте [32].Одним из наиболее точных методов определения FRET является измерение характерного времени жизни флуоресценции (тау; τ) донорного флуорохрома с помощью флуоресцентной микроскопии времени жизни с визуализацией (FLIM) [33]. Зависимость FRET от расстояния предсказывает, что разделительная мембрана между молекулами донора и акцептора будет эффективно препятствовать передаче энергии. Основываясь на этой характерной особенности, мы стремились изучить относительную ориентацию мембран eGFP и myc-tag в клонах hCLN3-eGFP11-myc. Для этого мы временно трансфицировали химеры в клетки HeLa и окрашивали myc-tag моноклональным α-myc-антителом, непосредственно меченным DyLight547 в качестве акцептора FRET.Затем определяли основной τ донора eGFP в клетках, экспрессирующих химеры hCLN3-eGFP11 или hCLN3-eGFP11-myc, меченные антителом α-myc-DyLight547. Хотя в клетках, экспрессирующих только клон hCLN3-eGFP11, не наблюдалось обнаруживаемого связывания антитела α-myc-DyLight547, биэкспоненциальная подгонка выявила присутствие двух популяций за время жизни eGFP (τ ₁ = 2,28 нс ± 0,02 и τ ₂ = 2,14 нс ± 0,01). В то время как прежнее значение τ ₁ представляет собой внутреннее время жизни eGFP, уменьшенное значение τ ₂ индуцируется либо гомо-FRET между соседними молекулами eGFP, либо неспецифическим связыванием антитела α-myc-DyLight547 и транслируется в FRET. КПД ∼4%.Анализ FLIM на клетках, экспрессирующих химеры hCLN3-eGFP11-myc и совместно окрашенных антителом α-myc-DyLight547, экспонировал уменьшенное среднее значение τ ₁ в диапазоне от 2,05 нс ± 0,04 до 1,71 нс ± 0,04 (рисунок 2B, середина в нижнем ряду). Снижение τ ₁ варьировалось для каждого химерного клона hCLN3 и предполагает связь между τ _1, сайтом встраивания myc-метки вдоль пептида hCLN3 и ориентацией мембраны myc-tag по отношению к донору eGFP. (Рисунок 2C).

Радиус Ферстера R ₀ описывает внутримолекулярное расстояние донор-акцептор, при котором вероятность возникновения FRET составляет 50%, а эффективность FRET составляет 50%.Статистически надежный диапазон для FRET определяется R ₀ ± 50% R ₀, что соответствует эффективности FRET 8,4% и 91,2% [32]. Эффективность FRET для наших химерных клонов hCLN3 рассчитывалась по уменьшению времени жизни флуоресценции (τ) в донорно-акцепторных образцах по сравнению с τ контрольных образцов, содержащих только донор. Применяя нижний порог 8,4% (серая зона на рисунке 2C), мы идентифицировали химерные клоны, дающие значительный FRET. Основываясь на текущих консенсусных моделях топологии мембран для CLN3, показывающих как амино- и карбоксильные концы, так и аминокислоту 401 на цитозольной стороне мембраны, мы предполагаем одинаковое цитозольное расположение для eGFP, вставленного после аминокислоты 406 [17].Таким образом, myc-теги в химерных клонах со значительным FRET, вероятно, будут разделять цитозольное местоположение с eGFP. Клон hCLN3-eGFP11-myc1 (а.о. 37) давал эффективность FRET 12,0% ± 1,9, что указывает на то, что как eGFP, так и myc-tag, скорее всего, находятся на цитозольной стороне мембраны. Эффективность FRET от клонов hCLN3-eGFP11-myc5 (aa 151) и клона hCLN3-eGFP11-myc6 (aa 204), составляющая 17,0% ± 0,6 и 14,7% ± 2,0, соответственно, предполагает цитозольное расположение обоих этих myc-tag. сайты прошивки.FRET от остальных клонов не имел значения.

Составление FRET и предыдущих данных в качестве новой модели для hCLN3

Две последние модели мембранной топологии для CLN3 основаны на нескольких алгоритмах прогнозирования, ограниченных доступными экспериментальными данными. Рисунок 3A иллюстрирует наши сайты вставки myc-tag и eGFP в этих моделях (Рисунок 3A; [25]). В 2009 г. Bernsel, et al. опубликовал алгоритм прогнозирования TOPCONS (далее именуемый TC), который определяет наиболее вероятную топологию мембраны на основе консенсуса между несколькими отдельными алгоритмами [34].TC выполняет прогноз для данной пептидной последовательности с помощью алгоритмов прогнозирования SCAMPI-seq, SCAMPI-msa, PRODIV, PRO OCTOPUS и OCTOPUS, а предоставленная оценка надежности для каждой аминокислоты отражает соответствие между различными алгоритмами. Кроме того, TC рассчитывает расстояние от центра мембраны для каждой аминокислоты (Z-оценка), а также значение свободной энергии (ΔG) для внедрения в мембрану [25], [34] — [36]. Мы решили тщательно изучить наши данные FRET с помощью цикла итеративных предсказаний TC, как описано ниже.Чтобы установить отправную точку, мы сначала выполнили предсказание без ограничений для нативного пептида hCLN3. График оценки надежности для предсказанной структуры с 10 трансмембранными доменами (TMD; не показано) и одинаковым расположением для обоих концов показал плохое согласие между используемыми алгоритмами (линия А на рисунке 3В). Затем, как предполагают данные FRET, прогноз, выполняемый путем ограничения обоих локусов тегов клона hCLN3-eGFP11-myc1 на цитозольной стороне, дал структуру топологии с увеличенным показателем надежности и в соответствии с существующими экспериментальными данными (не показаны) [17] .Мы продолжили с предсказания топологии для следующего положительного химерного клона FRET, который также был способен спасти лизосомный фенотип, hCLN3-GFP11-myc6. Здесь мы устанавливаем цитозольное ограничение для аминокислот 407 (eGFP) и 204 (myc-tag), которые в предыдущем предсказании уже находились в цитозоле. За исключением удлиненного цитозольного участка между доменами 4 и 5 TM, предсказание не показало значительных различий в топологии (не показано). Основываясь на приведенных выше данных, мы затем устанавливаем цитозольные ограничения для сайтов вставки myc-tag и eGFP транспозонов (а.о. 37), myc6 (а.о. 204) и eGFP11 (а.о. 407) для нативного hCLN3 без транспозонов.Результирующий прогноз показал в общей сложности 9 TMD с улучшенной оценкой надежности по сравнению с прогнозированием без ограничений (TMD не показаны; линия b на рисунке 3B). Мы наконец проверили, как более ранние экспериментальные данные будут соответствовать модели с использованием FRET. Мы устанавливаем дополнительные цитозольные ограничения для аминокислот 250–258, 401 и С-конца активного пептида hCLN3, как показано Киттэля, Мао и Сторчем [17], [22], [23]. Кроме того, мы устанавливаем ограничения просвета для аминокислотных остатков 71 и 85 из-за сообщения о N-гликозилировании этих остатков [23].Полученный прогноз показал 8 TMD с двумя значительными падениями в оценке надежности вокруг второго и третьего TMD, а затем и для пептида hCLN3 около аминокислоты 300 (TMD не показаны; линия c на рисунке 3B).

Рис. 3. In silico c компиляция FRET и других данных в виде моделей hCLN3 с использованием ограниченного алгоритма мембранного прогнозирования TOPCONS.

A: Показаны трансмембранные домены (серые), цитозольные (белые) и просветные (черные) петли из более ранних моделей hCLN3 вместе с сайтами вставки транспозонов (черные стрелки для myc-tag, зеленые для eGFP) [25]. B: Показатели надежности прогнозов топологии CLN3, указывающие на согласованность между различными алгоритмами прогнозирования, включенными в TOPCONS, показаны в процентах. C: Схематическое изображение новой топологии мембраны, полученное с использованием ограничений из анализа FRET, ранее опубликованных экспериментальных данных и итерационного подхода. Цитозольное ограничение с линией вверху отражает общий эпитоп для двух ранее использованных антител.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0102593.g003

Близость вставки myc-tag в hCLN3-eGFP11-myc2 после аминокислоты 86 сразу после сайта гликозилирования в аминокислоте 85 предполагает возможную корреляцию с расположением просвета и низким уровнем FRET. Сохраняя экспериментальные ограничения, использованные для модели выше (c на рисунке 3B), мы попытались найти наилучшее возможное местоположение для аминокислоты, следующей за myc-тегом остальных сайтов вставки по отдельности. В то время как цитозольное ограничение для аминокислоты 102 (myc3) не удалось вычислить, а ограничение мембраны привело к значительному снижению оценки надежности, ограничение просвета дало структуру с очень высокой оценкой надежности.Такая же картина наблюдалась при использовании сайта вставки myc-tag клона hCLN3-eGFP11-myc4 (aa 126). Ограничение просвета для аминокислоты 239 (myc7) не удалось вычислить, но как мембранные, так и цитозольные ограничения привели к высоким показателям надежности. Однако мембранное ограничение привело к появлению двух новых TMD и дало более низкую оценку надежности, чем цитозольное ограничение. Расчеты с ограничением мембраны для следующего сайта вставки (myc8, aa 280) дали наивысшую оценку надежности. Наконец, самые высокие оценки надежности для двух последних сайтов инсерции, myc9 и myc10, были получены при установке ограничения просвета для аминокислоты 346 и ограничения мембраны для аминокислоты 349.

Затем мы приступили к построению кумулятивных топологий мембран, начиная с любого конца белка CLN3. Начиная с C-конца, мы сначала устанавливаем ограничение просвета и мембраны для аминокислот 346 и 349 (myc9 и myc10, соответственно). Сохраняя эти ограничения, мы оценили все три ограничения для аминокислоты 280 (myc8) и выбрали мембранное ограничение, дающее лучший результат для следующего прогноза анализа аминокислоты 239 (myc7). Только цитозольное ограничение давало надежный прогноз, который сохранялся для прогноза для аминокислоты 126 (myc4).Здесь и цитозольные, и мембранные ограничения дают худшую оценку, чем люминальные ограничения. После добавления ограничения просвета для аминокислот 102 и 86 (myc3 и myc2 соответственно) мы наконец получили прогноз с высоким показателем для hCLN3 с шестью TMD между аминокислотами 38–58, 128–148, 152–172, 183–203, 278–298 и 347–367 (рис. 3C). Когда подход был повторен, начиная с N-конца, аналогичная топология была сгенерирована с TMD между аминокислотами в 38–58, 124–144, 150–170, 183–203, 278–298 и 347–367 (рис. 3C).Прогнозы с использованием скремблированного подхода, в котором порядок примененных ограничений был случайным, в равной степени привели к топологиям с шестью TMD с незначительной вариабельностью в исходной аминокислоте TMD 2 (не показано). Интересно, что общей чертой всех предсказаний была TMD между аминокислотами 152–172. Вспоминая высокое значение FRET, но очевидное нарушение функциональности клона hCLN3-eGFP11-myc5, мы предположили, что добавление myc-tag после аминокислоты 150 может изменить функцию, но не обязательно структуру сворачивания hCLN3.Из всех возможных ограничений для этого места вставки мы обнаружили, что ограничение на мембрану дает наивысшую оценку надежности (d на рисунке 3B).

Мы наконец проверили возможность того, что достаточное количество ограничений может заставить TC создать мембранную топологию с достаточно хорошей оценкой. Для этого мы попытались вычислить топологию мембран для hCLN3, используя набор из 20 строк ограничений по 10 ограничений в каждой. Только одной из строк удалось успешно вычислить с очень низким показателем надежности, что свидетельствует о надежности TC (не показано).

Обсуждение

В этом исследовании мы исследовали топологию мембраны человеческого белка CLN3 экспериментально путем измерения передачи энергии резонанса Фёрстера (FRET) между парой донор-акцептор FRET, вставленной в одну и ту же молекулу CLN3. Мы предположили, что расположение донора и акцептора на одной стороне мембраны приведет к измеримому FRET, в то время как расположение на противоположных сторонах мембраны будет ингибировать FRET. Химерные слитые белки CLN3 с eGFP в аминокислоте 406 и одной предшествующей myc-меткой по направлению к N-концу были получены с использованием стратегии транспозомного клонирования.Клоны сначала были протестированы на функциональность в клетках HeLa с использованием лизосомального нацеливания в качестве критериев, а затем в клетках Cb Cln3 ^{Δex7 / 8} путем определения их способности дополнять нарушенную функцию CLN3 [13]. Наконец, химеры были экспрессированы в клетках HeLa, и эффективность FRET была определена путем измерения времени жизни флуоресценции (FLIM) донора eGFP в присутствии антитела α-myc, конъюгированного с DyLight547. Уровень эффективности FRET различных химер позволил нам сделать выводы об относительной мембранной ориентации донорно-акцепторной пары.

Статистически надежные данные FRET использовались для ограничения прогноза TC вместе с другими доступными экспериментальными данными, а полученная топология была дополнительно уточнена с помощью итерационных циклов прогнозов TC для создания новой топологии мембраны hCLN3 с шестью трансмембранными доменами и цитозольными N- и C- termini (рисунок 4). Сгенерированная модель могла вместить почти все доступные экспериментальные данные с очень высокой степенью соответствия между всеми алгоритмами прогнозирования мембран, включенными в TC.Вариации длины и начальной точки ТМ-доменов со второго по четвертый сопровождались незначительным снижением оценки. Предсказанная топология имеет C-концевой сдвиг второго TM домена, который по сравнению с более ранними моделями создает расширенную первую люминальную петлю [24], [25].

Рис. 4. Иллюстрация новых моделей топологии полноразмерных и усеченных форм человеческого CLN3.

Сайты вставки Myc-tag и eGFP проиллюстрированы на новой модели топологии мембраны для полноразмерного человеческого CLN3 (слева), созданного с помощью Protter [39].Соответствующая топология наиболее распространенного усеченного белка hCLN3 без сайтов встраивания показана справа. Линия указывает на общий эпитоп, используемый для генерации антител, используемых ранее [17], [21].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0102593.g004

Наш проект не основывался на гипотезах, поскольку у нас не было причин предполагать, существует ли корреляция между функциональностью CLN3 и таргетингом на лизосомы. Однако, основываясь на данных валидации, кажется, что нацеливание на лизосомы само по себе не гарантирует функциональности.Кроме того, поскольку мы не могли ожидать, что какие-либо химерные клоны определенно будут продуцировать FRET, у нас не было «положительного контроля», и, таким образом, интерпретация наших результатов следует логическим рассуждениям. Хотя некоторые из положительных данных FRET действительно согласуются с существующими моделями топологии, такими как модель химерного клона myc1, наши данные могут также продемонстрировать новшества в структуре hCLN3. Согласно более ранним моделям химерный клон myc5 с люминальной myc-меткой, вставленной после аминокислоты 151, не должен разрешать FRET; однако, хотя вставка в этот сайт, по-видимому, делает клон нефункциональным, оно дает самые высокие показания FRET.Кроме того, myc-tag в химерном клоне myc6, вставленный после аминокислоты 203, должен фактически находиться на просветной стороне мембраны; тем не менее, этот клон был функциональным и продуцировал значительную FRET. Накопление положительных результатов FRET от функциональных химерных клонов вместе с большинством других существующих экспериментальных данных привело к модели топологии, в которой эти два сайта вставки расположены близко к цитозольным сторонам TMD 3 и 4 соответственно [17], [22], [ 29]. Попытки подобрать модель с люминальным N- и цитозольным С-концом дали чрезвычайно низкий балл надежности.Низкие показатели надежности также являются результатом установления ограничений просвета для аминокислот 163–210 или 199. Возможно, что ранее считавшаяся второй TM представляет собой амфипатическую спираль, частично встроенную в мембрану со стороны просвета.

Хотя можно предположить множество причин, наши данные не предлагают объяснения очень низкой эффективности FRET от клона hCLN3-eGFP11-myc7, который, согласно нашей модели и моделям других, действительно должен находиться на цитозольной стороне и, таким образом, быть доступным для формирования FRET с помощью eGFP.Возможными объяснениями могут быть расположение в просвете, неблагоприятная относительная диполь-дипольная ориентация антитела, связанного с myc-tag по отношению к eGFP, или маскирующий эффект за счет белок-белковых взаимодействий. Чтобы проверить возможность того, что дополнительные трансмембранные домены, образованные двумя гидрофобными участками между аминокислотами 212–232 и 363–384, как предполагает неограниченный прогноз TC, [25], но противостоят [17], повернут myc7 в со стороны просвета и, таким образом, ограничить FRET, мы попытались вычислить модель топологии с TC, ограничивая эти области как трансмембранные домены.В любой комбинации с нашими данными, приведенными выше, добавление этих областей в качестве доменов TM привело к сбою в вычислениях (не показано). Только когда большинство ограничений, полученных нами выше, было снято, TC удалось вычислить топологию с очень низким показателем надежности (не показан). Взятые вместе, эти баллы и высокая оценка надежности цитозольного myc7 предполагают другие причины в качестве источника низкого FRET, такие как неблагоприятная относительная диполь-дипольная ориентация антитела, связанного с myc-tag по отношению к eGFP, или стерическое тормозящий эффект за счет белок-белковых взаимодействий.

Насколько точно наша структурная модель действительно отражает модель нативного hCLN3, можно оценить, если структура hCLN3 была решена с помощью биофизических методов с высоким разрешением, например Рентгеновская кристаллография. Если наша модель действительно окажется верной, то C-конец наиболее распространенной усеченной формы hCLN3, возникающий в результате делеции гена 1,02 т.п.н., скорее всего, будет иметь цитозольную ориентацию вместо предполагаемой до сих пор просветной ориентации (правая модель на рисунке 4). . Это может иметь интересные последствия с точки зрения понимания предполагаемой остаточной функциональности мутантного CLN3 и его роли в патологии JNCL [37].Таким образом, модель топологии, представленная в этом исследовании, следует учитывать при проектировании, выполнении или оценке будущих экспериментальных работ по белку CLN3 или при разработке подходящих инструментов для понимания деталей биологической роли CLN3 и его мутаций, особенно при патологии JNCL.

Материалы и методы

Получение транспонированных клонов hCLN3

Транспозон, кодирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) и кассету для селекции антибиотиков канамицина, амплифицировали из матричной плазмиды 24.6 (добрый подарок доктора Дугласа Шеридана [26]) с ДНК-полимеразой Accuzyme (Bioline, Luckenwalde, Германия) с 20 циклами ПЦР с использованием праймеров Tn5

fw 5′-CTGTCTCTTATACACATCT-3 ‘

и очищен с помощью вакуумного коллектора Qiagen (Qiagen, Hilden, Германия). 200 нг плазмиды клонирования pCMV5, содержащей ген CLN3 человека между сайтами рестрикции EcoRI и BamHI (любезный подарок доктора Ритвы Тикканен, Университет Гисена, Германия), смешивали с эквимолярным соотношением амплифицированного транспозона в буфере для реакции транспозазы в соответствии с инструкциями производителя. протокол (Эпицентр, Мэдисон, США).Добавляли 1 мкл фермента транспозазы и реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч при + 37 ° C. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл стоп-раствора. 1 мкл реакционной смеси трансформировали в электрокомпетентный OneShot E .Coli (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) и высевали на чашки с агаром, содержащим 100 мкг / мл ампициллина и 50 мкг / мл канамицина (Roth Biochemicals, Карлсруэ, Германия. ). Реакцию ПЦР проводили на колониях с двойной устойчивостью с использованием праймеров, специфичных для вектора pCMV5

fw 5′-CGTTGACGCAAATGGGCGG-3 ‘и

rv 5′-CCTCCACCCCATAATATTATAGAAGGACAC-3 ‘

ПЦР из колоний с двойной устойчивостью, содержащих транспозон в кодирующей последовательности hCLN3, генерировал ∼0.Полоса на 6 т.п.н. больше, чем у CLN3-pCMV5 на 1,3 т.п.н., из-за вставок вне последовательности hCLN3. Чтобы проверить правильность ориентации встроенного транспозона, положительные клоны анализировали с помощью ПЦР с использованием праймера pCMV5-fw, описанного выше, и праймера eGFP-rv

5′-TTTACGTCGCCGTCCAG-3 ‘

кДНК положительных клонов амплифицировали и проверяли на правильность вставки в рамку считывания путем временной трансфекции в клетки HeLa (см. Ниже). Для удаления кассеты селекции канамицина из клонов кДНК, продуцирующих видимый сигнал eGFP, плазмиды, расщепленные SrfI (Stratagene, La Jolla, CA, USA), выделяли гель-электрофорезом, повторно лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 (Thermo Fischer Scientific, Вильнюс, Литва) и трансформируется в XL1-Blue E. Coli (Технологии жизни). Были приготовлены минипрепараты плазмид, и сайт встраивания транспозона был определен путем секвенирования с использованием праймера GFP-rv, описанного выше. Транспозон, встроенный в пептидную последовательность hCLN3, состоит из eGFP, фланкированного изолирующими пептидами из 9 и 12 аминокислот по направлению к N- и C-концу, соответственно. Кроме того, последние три аминокислоты пептидной последовательности hCLN3 перед транспозоном реплицируются в конце транспозона [26].

Myc-tag, кодирующий пептидную последовательность MEQKLISEEDL, фланкированную сайтами рестрикции AscI, получали путем отжига смеси с верхним и нижним олигонуклеотидами AscI-myc

5′-GGCGCGCCATGGAACAAAAACTAATAAGCGAAGAAGAC

CTAGGCGCGCC-3 ′

и использовался в качестве матрицы в 25 циклах ПЦР с использованием полимеразы Phusion PCR (Finnzymes Oy, Espoo, Finland) с праймерами AscI-myc-fw и –rv

5′-GGCGCGCCATGGAACAAA-3 ‘и

5′-GGCGCGCCCTAGGTCTTC-3 ‘

продуктов ПЦР и транспонированные клоны hCLN3-eGFP расщепляли с помощью AscI (SgsI, Fermentas, St.Леон-Рот, Германия) и очищали на пластине для вакуумной очистки Millipore (Millipore, Швальбах, Германия). Вставки и векторы повторно лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4. Ориентацию вставок в трансформированных XL-1 Blue и устойчивых к ампициллину колониях исследовали с помощью ПЦР с использованием pCMV5-fw и AscI-myc-rv и проверяли секвенированием. Полипептидная последовательность полного транспозона myc длиной 32 аминокислоты составляет

N-… CLN3_LSLIHIWRA MEQKLISEEDL IRRARADVYKRQ… CLN3-C

Химерные клоны CLN3-eGFP-myc получали с использованием процедуры гибридной ПЦР.Сначала клоны CLN3, содержащие вставку myc, использовали в качестве матриц для амплификации первой половины CLN3 до аминокислоты 406 с использованием праймеров pCVM5-fw (см. Выше) и CLN3-mid-comp

fw 5′-GAGACAGCTCCCGGTGCTCATCACT-3 ‘.

Параллельно клон hCLN3-eGFP11 использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР с CLN3-mid-top

fw 5′-AGTGATGAGCACCGGGAGCTGTCTC-3 ‘

и праймеры pCVM5-rv для амплификации второй половины CLN3-eGFP. Затем продукты ПЦР очищали, смешивали в эквимолярных соотношениях и амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров pCMV5 fw- и –rv.Полученные продукты ПЦР, кодирующие hCLN3, меченные myc и eGFP, расщепляли EcoRI и BamHI (Thermo Fischer Scientific) и лигировали в пустую плазмиду для клонирования pCVM5. После лигирования и трансформации плазмиды амплифицировали и секвенировали.

Клеточные культуры и трансфекции

клеток HeLa культивировали в увлажненном инкубаторе для клеточных культур (+ 37 ° C, 5% CO ₂) в среде DMEM (Life Technologies), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS, PAA Laboratories, Германия) и 1% Pen- Стрептококковые антибиотики (Life Technologies).Культивируемые зернистые клетки мозжечка, полученные из мышей CD1- Cln3 ^{Δex7 / 8} (дар доктора Сьюзан Котман, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США), поддерживали в увлажненном инкубаторе для культур клеток (+ 33 ° C, 5 % CO2) в среде для роста гранулярных нейронов (среда Игла, модифицированная Дульбекко, Life Technologies), 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Мюнхен, Германия) с добавлением 1% антибиотиков Pen-Strep, 24 мМ KCl и 200 мкг / мл G418 Geneticin (Life Technologies).

Для трансфекций использовали реагент MATra-A (IBA GmbH, Геттинген, Германия).За день до трансфекции клетки HeLa или Cb Cln3 ^{Δex7 / 8} обрабатывали трипсином и повторно наносили на стеклянные покровные стекла # 1, помещенные в 12- или 24-луночные планшеты при 2,0 × 10 ⁵ или 3,0 × 10 ⁵ клеток / лунку (для HeLa и Cb Cln3 ^{Δex7 / 8} клеток, соответственно) и выращивали в течение ночи. На следующий день клетки трансфицировали методом MATra согласно протоколу производителя. Вкратце, 0,1 мкл реагента MATra и 5 мкл бессывороточной среды DMEM добавляли к 100 нг плазмидной ДНК / на см ² площади лунки и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.Затем всю смесь добавляли к культуральной среде в планшетах с лунками. Затем планшеты помещали на магнит MATra на 20 минут при + 37 ° C или + 33 ° C (клетки HeLa и Cb Cln3 ^{Δex7 / 8} соответственно). Через 22 часа после трансфекции клетки либо фиксировали (для конфокальной микроскопии и микроскопии FRET), либо обрабатывали для визуализации живых клеток.

Флуоресцентная микроскопия

Для подготовки образцов для конфокальной микроскопии и FRET-микроскопии клетки HeLa выращивали и трансфицировали соответствующими плазмидами с использованием реагента MATra-A, как описано выше.Через 22 часа после трансфекции клетки промывали четыре раза забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS, pH 7,4) и фиксировали 4% параформальдегидом (Sigma-Aldrich) в PBS в течение 30 минут. Образцы промывали четыре раза по 5 минут PBS, повышали проницаемость в течение 5 минут при комнатной температуре с помощью 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) и гасили 50 мМ глицином еще в течение 10 минут (растворы в PBS). Для маркировки антител образцы блокировали при комнатной температуре в течение 30 минут с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma-Aldrich) и 0,1% желатина холодноводных рыб (CWFG, Sigma-Aldrich) в PBS и дважды промывали инкубационной средой (0 ° C). .5% BSA и 0,1% CWFG). Образцы для визуализации FRET инкубировали с разведенным в среде инкубации 1-500 моноклональным α-myc-антителом, непосредственно конъюгированным с DyLight547, в соответствии с протоколом производителя (PIERCE, Offenbach, Германия). Затем образцы FRET промывали несколько раз PBS и помещали на предметные стекла с помощью Mowiol-PBS (Mowiol-88, Sigma-Aldrich) без реагента против выцветания.

Образцы для исследований колокализации инкубировали с поликлональным кроличьим α-LAMP-1 антителом (Sigma-Aldrich), разведенным 1 × 100, и / или моноклональным α-myc антителом, разведенным в инкубационной среде в течение 1 ч при комнатной температуре, промытых той же средой. и инкубировали с флуоресцентными вторичными антителами (козьим α-мышиным Alexa-488 и козьим α-кроликом Alexa-568; Dianova, Гамбург, Германия), разведенными в инкубационной среде в течение 1 ч при комнатной температуре.Затем клетки промывали четыре раза инкубационной средой, дважды PBS и помещали на предметные стекла с Mowiol-PBS без реагента против выцветания. Клетки визуализировали с помощью конфокального сканирующего лазерного микроскопа Leica SP2 AOBS (Leica Microsystems, Гейдельберг, Германия) с использованием масляного иммерсионного объектива 63 × 1,42NA и соответствующих линий лазерного возбуждения и эмиссионных окон с отверстием, установленным на 1 единицу Эйри, и регулировкой усиления фотоумножителя. чтобы избежать насыщения.

Для визуализации живых клеток клетки HeLa выращивали на предметных стеклах со стеклянным дном (Nunc, Wiesbaden, Германия) до 30% слияния и трансфицировали реагентом MATra-A, как описано выше.На следующий день клетки инкубировали в течение 30 минут с витальным красителем LysoTracker Red DND-99, разбавленным до конечной концентрации 500 нМ средой для культивирования клеток, дважды промывали средой для визуализации (DMEM без фенолового красного, 10% FCS, 1% PenStrep, 25 мМ HEPES, (Life Technologies)), и переносили в той же среде в специально созданную адаптированную камеру для получения изображений в реальном времени, нагретую до + 37 ° C на конфокальном сканирующем лазерном микроскопе Leica SP2 AOBS. Клетки визуализировали при 0,2 Гц с использованием иммерсионного объектива с числовой апертурой 63 × 1,32 в режиме строчной развертки с соответствующими настройками возбуждения и излучения.

Спасательная проба

Cb Cln3 ^{Δ ex7 / 8} клетки, описанные ранее [13], выращивали в условиях конфлюэнтности в течение 7 дней для индукции накопления запасного материала, обрабатывали трипсином и подсчитывали. 3 × 10 ⁴ клеток / лунку высевали на 13 мм стеклянные покровные стекла # 1 в 24-луночном планшете для тканевых культур и инкубировали в течение ночи. На следующий день клетки трансфицировали 100-250 нг / см кДНК ² лунок с использованием реагента MATra-A, как описано выше.На следующий день в среду добавляли свежую среду, содержащую LTR, до конечной концентрации 500 нМ, и клетки снова помещали в инкубатор еще на 30 минут. Клетки промывали четыре раза PBS, фиксировали, как описано выше, с последующей 10′-пермеаблизацией дигитонином (20 мкг / мл в PBS), 10′-гашением глицином (50 мг / мл) и 10′-инкубацией со смесью DAPI. (1-2000) и конъюгированный с Alexa-647 агглютинин зародышей пшеницы (оба Life Technologies) в PBS. Затем образцы промывали четыре раза в течение 5 минут PBS и помещали на предметные стекла с помощью Mowiol, как указано выше.Образцы получали изображения за один сеанс с идентичными настройками либо с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica SP5 AOBS (Leica), используя диодный лазер 405 для возбуждения DAPI, либо с использованием лазерных линий Argon 488, HeNe 543 и 633 для GFP, LTR и WGA. -647 возбуждения соответственно и масляный иммерсионный объектив с числовой апертурой 63 × 1,42 NA. В качестве альтернативы образцы получали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axiovert 200 M (Zeiss, Оберкохен, Германия) с соответствующими наборами фильтров возбуждения и испускания для DAPI, GFP, LTR и Alexa-647, используя 16-битную научную CCD-камеру MicroLine (Finger Lake Instruments, Рочестер, штат Нью-Йорк, США) и 63 × 1.Масляный иммерсионный объектив 4 NA. Используя программное обеспечение для анализа изображений Cell Profiler, были идентифицированы небольшие LTR-положительные везикулы (размер от 1 до 3 мкм), которые были подсчитаны для каждой клетки в поле зрения и коррелировали с наличием или отсутствием экспрессии eGFP [38]. Обе системы визуализации дали сопоставимые результаты, и количество мелких LTR-положительных везикул в трансфицированных клетках выражали как отношение к количеству маленьких LTR-положительных везикул, подсчитанных в нетрансфицированных клетках. Представленные данные представляют собой среднее значение по меньшей мере трех повторных анализов (N = 3-5 для каждого клона) с по меньшей мере 15 трансфецированными клетками на набор данных (n = 45-75).Статистический анализ был выполнен с помощью ANOVA, и планки ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM). Программное обеспечение Cell Profiler и используемые конвейеры анализа можно получить на сайте http://www.cellprofiler.org.

Математический анализ колокализации

Колокализация сигнала в двух разных конфокальных каналах была рассчитана с помощью алгоритма корреляции асимметрии изображения, позволяющего проводить несмещенный анализ [30]. Короче говоря, изображения для каждого канала были импортированы в MatLab как 8-битные изображения, нормализованные до максимума и отфильтрованные с помощью ядра Винера 2D размером 3×3 пикселя и усреднения 3×3 пикселя.Применяли нулевое гашение и устанавливали порог 10 отсчетов для колокализованного изображения. Долю пикселей, совместно локализующихся с LAMP-1, наносили на график как функцию сайта вставки myc-тега, для оценки значимости использовали t-критерий Стьюдента, а столбцы ошибок представляют SEM.

Визуализация времени жизни флуоресценции и анализ FRET

Для определения времени жизни флуоресценции (тау, τ) донорного флуорохрома (eGFP) образцы возбуждали фемтосекундным двухфотонным лазером с усилением импульса Coherent MIRA (Coherent, Göttingen, Германия) на длине волны 900 нм.Эмиссия собиралась с использованием фильтра 505/30 BP и масляного иммерсионного объектива с числовой апертурой 63 × 1,42 в течение 10 минут с устройством для подсчета единичных фотонов с временной корреляцией (TCSPC, Becker & Hickl GmbH, Берлин, Германия), подключенным к инвертированному Leica DM IRE2 AOBS. конфокальный микроскоп (Leica). Распределение τ в каждом изображении было проанализировано с помощью программного обеспечения анализа TCSPC v.2.4 (Becker & Hickl) путем объединения необработанного сигнала с коэффициентом 5, пиксели с менее чем 25 отсчетами были отфильтрованы как фоновая флуоресценция, а время жизни донора соответствовало спаду. был рассчитан с использованием биэкспоненциальной аппроксимации.Данные о продолжительности жизни (τ1 и τ2) были импортированы в программное обеспечение статистического анализа Origin Pro 7.0 (OriginLab Corp., Нортгемптон, Массачусетс, США), и для определения пика обеих популяций продолжительности жизни использовалась одна подгонка по Гауссу. Эффективность FRET в донорно-акцепторных образцах рассчитывалась по формуле:% FRET = (1- (τ _донор + _{акцептор} / τ _донор)) * 100.

, используя популяцию донора с более низкой продолжительностью жизни в качестве эталона. Значимость различий между донорской и другими выборками была рассчитана с применением двустороннего Т-критерия Стьюдента для гетероскедастических наборов данных (неравные дисперсии).Вариации в пределах одинаковых выборок рассчитывались с помощью Т-критерия Стьюдента; парные или для гетероскедастических наборов данных (неравные наборы данных). Планки погрешностей представляют SEM.

Алгоритм прогнозирования мембранной области TOPCONS

Веб-алгоритм прогнозирования консенсусной топологии мембраны TOPCONS использовался в соответствии с интерактивными инструкциями, доступ к нему можно получить по адресу http://topcons.cbr.su.se/[34]. На основе каждой попытки предсказания строили изображение, описывающее трансмембранные домены и оценку надежности, и сохраняли файл данных с вычисленными параметрами для дальнейшего изучения.

Благодарности

Авторы благодарны техническому персоналу Европейского института нейробиологии (Геттинген, Германия) за поддержку в использовании установки FLIM для анализа FRET, а также доктору Алессандро Эспозито (MRC, Кембридж, Великобритания) за совместное использование процедур MatLab. M.R. выражает благодарность доктору Ритве Тикканен (Институт биохимии, медицинский факультет, Университет Гисена, Германия) за предоставление плазмиды pCMV5-hCLN3 и критическое прочтение рукописи, а также докторуДугласу Шеридану за совместное использование транспозона eGFP. Д-р Сьюзан Котман получила признание за предоставление гранулярных клеток мозжечка, используемых в тестах на спасение.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: ER AP JRM MR. Проведены эксперименты: ER AP JRM MR. Проанализированы данные: ER AP JRM MR. Написал документ: ER AP JRM MR.

Ссылки

1. Cotman SL, Karaa A, Staropoli JF, Sims KB (2013) Нейрональный цероидный липофусциноз: влияние последних генетических достижений и расширение клинико-патологического спектра.Curr Neurol Neurosci Rep 13: 366.
2. Андерсон GW, Goebel HH, Simonati A (2013) Патология человека в NCL. Biochim Biophys Acta 1832: 1807–1826.
3. Mole SE, Williams RE, Goebel HH (2005) Корреляции между генотипом, ультраструктурной морфологией и клиническим фенотипом в нейрональных цероидных липофускинозах. Нейрогенетика 6: 107–126.
4. Kohlschutter A, Schulz A (2009) К пониманию нейрональных цероидных липофускинозов. Brain Dev 31: 499–502.
5. Jalanko A, Braulke T (2009) Нейрональные цероидные липофусцинозы. Biochim Biophys Acta 1793: 697–709.
6. Палмер Д. Н., Фернли И. М., Уокер Дж. Э., Холл Н. А., Лейк Б. Д. и др. (1992) Хранение субъединицы c митохондриальной АТФ-синтазы в цероид-липофускинозах (болезнь Баттена). Am J Med Genet 42: 561–567.
7. Джонсон Д.В., Шпейер С., Циан У.Х., Лейн С., Кук А. и др. (1995) Роль субъединицы 9 митохондриальной АТФ-синтазы в болезни Баттена. Am J Med Genet 57: 350–360.
8. Лебрун А.Х., Молл-Хосрави П., Поль С., Макрипиди Г., Сторч С. и др. (2011) Анализ потенциальных биомаркеров и генов-модификаторов, влияющих на клиническое течение болезни CLN3. Мол Мед 17: 1253–1261.
9. Goebel HH, Wisniewski KE (2004) Текущее состояние клинических и морфологических особенностей NCL человека. Brain Pathol 14: 61–69.
10. Старополи Дж. Ф., Халиу Л., Бисвас С., Гарретт Л., Холтер С. М. и др. (2012) Крупномасштабное фенотипирование точной генетической модели JNCL на мышах выявляет новую раннюю патологию вне центральной нервной системы.PLoS One 7: e38310.
11. Ostergaard JR, Rasmussen TB, Molgaard H (2011) Поражение сердца при ювенильном нейрональном цероид-липофусцинозе (болезнь Баттена). Неврология 76: 1245–1251.
12. Выделение нового гена, лежащего в основе болезни Баттена, CLN3. Международный Консорциум Болезни Баттена. Ячейка 82: 949–957.
13. Фоссале Э., Вольф П., Эспинола Дж. А., Любич-Навроцка Т., Тид А. М. и др. (2004) Мембранный транспорт и митохондриальные аномалии предшествуют отложению субъединицы c в модели ювенильного нейронального цероидного липофусциноза на клетках мозжечка.BMC Neurosci 5: 57
14. Котман С.Л., Врбанак В., Лебель Л.А., Ли Р.Л., Джонсон К.А. и др. (2002) Cln3 (Deltaex7 / 8) «нокаутированные» мыши с общей мутацией JNCL демонстрируют прогрессирующее неврологическое заболевание, которое начинается еще до рождения. Hum Mol Genet 11: 2709–2721.
15. Holopainen JM, Saarikoski J, Kinnunen PK, Jarvela I (2001) Повышенный лизосомный pH в нейрональных цероидных липофускинозах (NCL). Eur J Biochem 268: 5851–5856.
16. Падилья-Лопес С., Пирс Д.А. (2006) Saccharomyces cerevisiae, лишенные Btn1p, модулируют активность вакуолярной АТФазы для регулирования дисбаланса pH в вакуоли.J Biol Chem 281: 10273–10280.
17. Kyttala A, Ihrke G, Vesa J, Schell MJ, Luzio JP (2004) Два мотива нацелены на белок CLN3 болезни Баттена в лизосомы в трансфицированных ненейрональных и нейрональных клетках. Mol Biol Cell 15: 1313–1323.
18. Джейнс Р.В., Манро П.Б., Митчисон Н.М., Гардинер Р.М., Моле С.Е. и др. (1996) Модель белка болезни Баттена CLN3: функциональные последствия гомологии и мутаций. FEBS Lett 399: 75–77.
19. Pearce DA, Sherman F (1997) BTN1, дрожжевой ген, соответствующий человеческому гену, ответственному за болезнь Баттена, не важен для жизнеспособности, митохондриальной функции или деградации митохондриальной АТФ-синтазы.Дрожжи 13: 691–697.
20. Kim Y, Ramirez-Montealegre D, Pearce DA (2003) Роль в вакуолярном транспорте аргинина для дрожжевого Btn1p и для человеческого CLN3, белка, дефектного при болезни Баттена. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 15458–15462.
21. Ezaki J, Takeda-Ezaki M, Koike M, Ohsawa Y, Taka H и др. (2003) Характеристика Cln3p, продукта гена, ответственного за цероидный липофусциноз ювенильных нейронов, как лизосомного интегрального мембранного гликопротеина. J Neurochem 87: 1296–1308.
22. Мао Q, Фостер BJ, Xia H, Davidson BL (2003) Мембранная топология CLN3, белка, лежащего в основе болезни Баттена. FEBS Lett 541: 40–46.
23. Storch S, Pohl S, Quitsch A, Falley K, Braulke T (2007) C-терминальное пренилирование мембранного гликопротеина CLN3 необходимо для эффективной эндосомной сортировки до лизосом. Трафик
24. Филлипс С. Н., Бенедикт Дж. В., Веймер Дж. М., Пирс Д. А. (2005) CLN3, белок, связанный с заболеванием лопатки: структура, функция и локализация.J Neurosci Res 79: 573–583.
25. Nugent T, Mole SE, Jones DT (2008) Трансмембранная топология белка болезни Баттена CLN3, определенная консенсусным расчетным предсказанием, ограниченным экспериментальными данными. Письма FEBS 582: 1019–1024.
26. Шеридан Д.Л., Берлот С.Х., Роберт А., Инглис Ф.М., Якобсдоттир К.Б. и др. (2002) Новый способ быстрого создания функциональных флуоресцентных гибридных белков: случайная вставка GFP с реакцией транспозиции in vitro.BMC Neuroscience 3: 7.
27. Sheridan DL, Hughes TE (2004) Более быстрый способ создания биосенсоров на основе GFP: два новых транспозона для создания разноцветных библиотек флуоресцентных слитых белков. BMC Biotechnol 4: 17.
28. Джарвела I, Сайнио М., Рантамаки Т., Олкконен В.М., Карпен О. и др. (1998) Биосинтез и внутриклеточное нацеливание белка CLN3, дефектного при болезни Баттена. Hum Mol Genet 7: 85–90.
29. Jarvela I, Lehtovirta M, Tikkanen R, Kyttala A, Jalanko A (1999) Дефектный внутриклеточный транспорт CLN3 является молекулярной основой болезни Баттена (JNCL).Hum Mol Genet 8: 1091–1098.
30. Esposito A, Dohm CP, Kermer P, Bahr M, Wouters FS (2007) альфа-синуклеин и его связанные с заболеванием мутанты по-разному взаимодействуют с тау-белком микротрубочек и связываются с актиновым цитоскелетом. Neurobiol Dis 26: 521–531.
31. Cao Y, Staropoli JF, Biswas S, Espinola JA, MacDonald ME, et al. (2011) Определенные ранние молекулярные ответы на мутации, вызывающие vLINCL и JNCL, предвещают накопление субъединицы C АТФ-синтазы в клетках мозжечка.PLoS One 6: e17118.
32. dos Remedios CG, Moens PD (1995) Флуоресцентная резонансная спектроскопия переноса энергии является надежным «правителем» для измерения структурных изменений в белках. Решение проблемы неизвестного фактора ориентации. J. Struct Biol 115: 175–185.
33. Gordon GW, Berry G, Liang XH, Levine B, Herman B (1998) Количественные измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии с использованием флуоресцентной микроскопии. Biophys J 74: 2702–2713.
34.Бернсел А., Виклунд Х, Хеннердал А., Элофссон А. (2009) TOPCONS: консенсусное прогнозирование топологии мембранных белков. Nucleic Acids Res 37: W465–468.
35. Грансет Э., Виклунд Х., Элофссон А. (2006) ZPRED: прогнозирование расстояния до центра мембраны для остатков в альфа-спиральных мембранных белках. Биоинформатика 22: e191–196.
36. Хесса Т., Майндл-Бейнкер Н.М., Бернсель А., Ким Х., Сато Й. и др. (2007) Молекулярный код распознавания трансмембранной спирали транслоконом Sec61.Природа 450: 1026–1030.
37. Kitzmuller C, Haines RL, Codlin S, Cutler DF, Mole SE (2008) Функция, сохраняемая общим мутантным белком CLN3, ответственна за позднее начало ювенильного нейронального цероидного липофусциноза. Молекулярная генетика человека 17: 303–312.
38. Карпентер А.Е., Джонс Т.Р., Лампрехт М.Р., Кларк С., Канг И.Х. и др. (2006) CellProfiler: программное обеспечение для анализа изображений для определения и количественной оценки фенотипов клеток. Геном Биол 7: R100.
39.Omasits U, Ahrens CH, Muller S, Wollscheid B (2014) Protter: интерактивная визуализация характеристик белка и интеграция с экспериментальными протеомными данными. Биоинформатика 30: 884–886.

Развитие сенсора киназы FRET выявляет активацию SnRK2 / OST1 посредством ABA, но не посредством MeJA, и высокий уровень CO2 во время закрытия устьиц

В растениях протеинкиназы SnRK2 играют решающую роль в ответах на абиотический стресс (Boudsocq and Laurière, 2005; Umezawa et al., 2009; Накашима и др., 2009; Fujita et al., 2009; Fujii and Zhu, 2009; Ли и др., 2000; Йошида и др., 2002; Mustilli et al., 2002). Активация протеинкиназ SnRK2 абсцизовой кислотой необходима для передачи сигнала ABA (Cutler et al., 2010; Raghavendra et al., 2010; Zhu, 2016). Однако общий метод анализа киназы в геле SnRK2 имеет значительные ограничения для мониторинга типа клеток, клеточного компартмента и зависящей от времени активации этих протеинкиназ. Анализы киназы в геле в замыкающих клетках Arabidopsis требуют очистки 10 ⁵ или более протопластов замыкающих клеток из более чем 100 листьев и 10 растений для каждой отдельной замыкающей клетки. Полоса анализа киназы в геле .Измерения FRET в реальном времени активности протеинкиназы SnRK2 в интактных отдельных растительных клетках и тканях с использованием репортера SNACS позволяют напрямую исследовать ключевые биологические вопросы в реальном времени, как показано здесь.

В этом исследовании мы разработали сенсор протеинкиназы SnRK2, SNACS, содержащий субстратный домен AKS1 и полноразмерный белок 14-3-3. Киназа SnRK2.6 / OST1 фосфорилировала сенсор SnRK2 в зависимости от остатка AKS1 Ser-30 in vitro (рис. 1C), который необходим для связывания с белком 14-3-3 при передаче сигнала ABA (Takahashi et al., 2013). Анализы in vitro и in planta показывают увеличение отношения FRET в зависимости от активности киназы SnRK2 (Фигуры 1D, E и 5). Мы также наблюдали индуцированное АБК увеличение соотношения FRET в эпидермальных клетках Nicotiana benthamiana и замыкающих клетках Arabidopsis (Фигуры 2 и 3). Фосфорилирование остатка AKS1 Ser-30 необходимо для связывания белка 14-3-3 с белком AKS1 (Takahashi et al., 2013). Примечательно, что мутантная изоформа сенсора AKS1 Ser-30-Ala не обнаруживает изменений соотношения FRET как in vitro, так и в растительных клетках (Фигуры 1F и 4).Эти результаты согласуются с моделью, в которой изменения в соотношении FRET происходят из конформационных изменений через связывание белка 14-3-3 с фосфорилированным доменом AKS1 в SNACS (рис. 1B). Полноразмерный белок AKS1 функционирует как фактор транскрипции в ядре. Однако домен bHLH AKS1, который важен для его функции транскрипционного фактора и ядерной локализации, был исключен из нашей сенсорной конструкции SNACS. Флуоресценция SNACS, по-видимому, наблюдается в основном в цитоплазме и в цитоплазматических пространствах между вакуолями, с возможной слабой экспрессией или отсутствием экспрессии в ядре (Рисунок 3 — Приложение к рисунку 1).Будущие исследования могут нацелить SNACS на ядро или другие клеточные компартменты.

ABA вызывает относительно небольшие сдвиги отношения SNACS FRET в замыкающих ячейках. Слепые эксперименты с контрольной обработкой ABA против EtOH и контроли с мутантными SNACS ^S785A и snrk2.2 / 2.3 / 2.6 тройными мутантными замыкающими клетками подтвердили ответ ABA SNACS (рисунки 3, 4 и 5). Были разработаны сенсоры протеинкиназ для протеинкиназ, которые показывают небольшие сдвиги соотношения от 1% до 4% и используются для решения ключевых биологических вопросов (например,g.Kajimoto et al., 2019). В нашем исследовании средний ответ SNACS на АБК составил 3,7 ± 0,2% (n = 46 устьиц, ± SEM). Низкий фоновый шум в этих датчиках киназ позволил анализировать активацию и ингибирование киназ в реальном времени (Kajimoto et al. , 2019). Следовательно, из-за небольших сдвигов соотношений, непрерывные записи в отдельных клетках необходимы для разрешения зависимых от стимулов изменений FRET (Allen et al., 1999), вместо того, чтобы исследовать сравнения соотношений FRET в разных клетках за один момент времени.Визуализация FRET с помощью SNACS позволяет получать изображения одного типа клеток в режиме реального времени, по сравнению с необходимостью очистки очень большого количества клеток и выделения экстрактов для каждой полосы анализа киназы в геле .

Ингибитор протеинкиназы K252a, который, как известно, нарушает передачу сигналов ABA в замыкающих клетках (Schmidt et al., 1995), ингибирует индуцированное ABA увеличение FRET (рис. 6A). Кроме того, тройные мутанты snrk2.2 / 2.3 / 2.6 не показали явного изменения отношения FRET, индуцированного АБК (рис. 5D). Эти данные предполагают, что изменения соотношения FRET, вызванные ABA, зависят от фосфорилирования белка (рис. 1C).Интересно, что мы также обнаружили, что K-252a вызывает уменьшение отношения SNACS FRET, когда K252a применялся после увеличения отношения FRET, индуцированного ABA (Рисунок 6C). Это согласуется с дефосфорилированием SNACS протеинфосфатазой в растительных клетках. Мы не исключаем возможность того, что K252a влияет на активность другой протеинкиназы в дополнение к активности SnRK2 (Рисунок 6 — рисунок в приложении 1). Ингибитор кальмодулина, который не ингибирует SnRK2.6 / OST1, не влиял на соотношения флуоресценции SNACS (рисунок 6E; рисунок 6 — приложение к рисунку 1).В ost1 / snrk2.6 одинарных мутантных замыкающих клетках и в snrk2.2 / snrk2.3 двойных мутантных замыкающих клетках ABA вызывала увеличение отношения FRET в SNACS, но не в snrk2.2 / 2.3 / 2.6 тройные мутантные замыкающие клетки (рис. 5). Кроме того, SNACS-зависимые сигналы FRET были обращены ингибиторами протеинкиназы (рис. 6). Вместе эти данные предполагают, что SNACS может сообщать о низкой базовой активности SnRK2 и что SNACS может динамически сообщать о биологических изменениях активности. HAB1 (также называемый AtP2C-HA) (Chérel et al., 2002; Саез и др., 2004; Leonhardt et al., 2004), протеинфосфатаза типа 2C, участвующая в передаче сигнала ABA, по-видимому, не дефосфорилирует остаток Ser-30 фактора транскрипции AKS1 (Takahashi et al., 2017). Фосфатазы PP2A могут дефосфорилировать AKS1 (Bu et al., 2017). K252a-индуцированное снижение соотношения SNACS FRET в замыкающих клетках свидетельствует о том, что репортер SNACS является обратимым. Потенциальная обратимость SNACS предполагает, что динамическую повышающую и понижающую регуляцию протеинкиназ SnRK2 можно исследовать в интактных растительных клетках в режиме реального времени.

Метилжасмонат (MeJA) — это растительный гормон, который участвует во многих процессах развития и важен для защитных реакций растений (Melotto et al., 2017). Однако MeJA, по-видимому, вызывает разные результаты регуляции устьиц в зависимости от условий. Опосредованное MeJA закрытие устьиц наблюдалось у нескольких видов, включая Paphiopedilum (Gehring, 1997), Vicia faba (Liu et al., 2002) и Arabidopsis (Suhita et al., 2004; Hossain et al., 2011). ; Munemasa et al., 2007; Munemasa et al., 2019; Инь и др., 2016; Förster et al., 2019). Однако в других исследованиях сообщалось, что MeJA не способствует закрытию устьиц (Montillet et al., 2013; Savchenko et al., 2014; Melotto et al., 2017; Zhu et al., 2020). Кроме того, протеинкиназа SnRK2.6 / OST1 необходима для MeJA-индуцированного закрытия устьиц из-за нарушенной MeJA-индуцированной реакции закрытия устьиц у мутантов snrk2.6 / ost1 (Yin et al., 2016). Кроме того, анализы киназы в геле и эпидермальных тканей, обогащенных замыкающими клетками, предполагают, что MeJA не активирует SnRK2.6 / OST1, хотя мутация OST1 / SnRK2.6 нарушает вызванное MeJA закрытие устьиц (Munemasa et al., 2019). В настоящем исследовании репортер SNACS не показал явного увеличения соотношений FRET в замыкающих клетках при применении 20 мкМ MeJA, что согласуется с данным исследованием с использованием эпидермальных тканей, обогащенных замыкающими клетками (Munemasa et al., 2019; Рисунок 7). Эти данные могут поддерживать недавно предложенный кальций-зависимый параллельный путь ответа MeJA (Förster et al., 2019). Сообщенный здесь датчик SNACS может быть использован для дальнейшего исследования передачи сигналов MeJA в различных условиях.

High CO ₂ и ABA вызывают быстрое закрытие устьиц. Исследования газообмена, движения устьиц и регуляции ионных каналов с использованием мутантных аллелей ost1 продемонстрировали, что протеинкиназа SnRK2.6 / OST1 играет роль в индуцированном CO ₂ закрытии устьиц (Xue et al., 2011; Merilo et al. , 2013; Hsu et al., 2018). Однако неожиданно анализы киназы в геле показали, что повышение уровня CO ₂ не увеличивает активность SnRK2.6 / OST1 в протопластах замыкающих клеток, даже несмотря на то, что высокий уровень CO ₂ активировал анионные каналы S-типа в той же системе (Hsu и другие., 2018). Однако оставалось неясным, может ли повышенный уровень CO ₂ активировать активность протеинкиназы SnRK2 в живых интактных замыкающих клетках. В настоящем исследовании мы использовали новый репортер SNACS для изучения передачи сигнала CO ₂ в интактных замыкающих клетках устьиц. Анализ FRET с временным разрешением в замыкающих клетках показывает, что повышение CO ₂ не вызывает измеримого увеличения отношения FRET для замыкающих клеток, экспрессирующих SNACS, тогда как последующее воздействие ABA вызывает явное увеличение отношения FRET (рис. 8A и B), что свидетельствует о в интактных замыкающих клетках этот высокий CO ₂ не активирует SnRK2.6 / ОСТ1 активность.

Исследования показали, что рецепторы ABA и OST1 / SnRK2.6 необходимы для закрытия устьиц дикого типа, такого как высокий уровень CO ₂ (Chater et al., 2015; Xue et al., 2011; Hsu et al., 2018 ). Классические исследования показали, что нестрессированные замыкающие клетки имеют более высокую концентрацию АБК, чем другие клетки листа (Lahr and Raschke, 1988), и совсем недавно это было показано экспериментально (Hsu et al., 2018; Yoshida et al., 2019). Для объяснения всех экспериментальных наблюдений была выдвинута гипотеза об основной активности киназы SnRK2 в нестрессированных замыкающих клетках (Hsu et al., 2018). Однако прямые измерения базальной активности SnRK2 в замыкающих клетках оказались невозможными. Интересно, что ингибитор протеинкиназы K252a вызывал явное снижение соотношения FRET репортера SNACS, а K252a ингибировал ABA-индуцированные изменения FRET в SNACS в замыкающих клетках (фиг. 6A и D). Кроме того, индуцированный ABA ответ SNACS нарушается у тройного мутанта snrk2.2 / 2.3 / 2.6 (рис. 5D). Эти данные предоставляют экспериментальные доказательства того, что протеинкиназы SnRK2 обладают базальной киназной активностью в замыкающих клетках даже в отсутствие экзогенного применения АБК.Обнаруженная здесь базальная активность SnRK2 может объяснить, почему мутантные аллели ost1 / snrk2.6 явно нарушены в индуцированном CO ₂ закрытии устьиц (Xue et al., 2011; Hsu et al., 2018; Merilo et al. ., 2013), но повышенный уровень CO ₂ не усиливает активность OST1 / SnRK2.6 (Рисунок 8): Настоящие данные предполагают, что базальная активность SnRK2, функционирующая параллельно ветви передачи сигнала CO ₂, необходима для и / или может усилить сигнализацию CO ₂.Более того, закрытие устьиц, вызванное высоким CO ₂, замедляется, но не нарушается в ost1 / snrk2.6 (Hsu et al., 2018). Это контрастирует с более сильным ABA-нечувствительным ответом мутантных аллелей ost1 / snrk2.6 (Mustilli et al., 2002; Yoshida et al., 2002). Эти данные согласуются с параллельной ролью ABA и OST1 в передаче сигнала CO ₂.

Недавнее исследование показало, что передача сигнала CO ₂ опосредуется PYL4 и PYL5, но не рецепторами PYL2 ABA (Dittrich et al., 2019). Этот вывод не может быть подтвержден в настоящем исследовании с использованием пятерых и шестерых мутантных растений по рецептору ABA более высокого порядка, которые включают нарушения генов PYL4 и PYL5 (Рисунок 9, Рисунок 9 — дополнение к рисунку 1, Рисунок 9 — приложение к рисунку 2 и Рисунок 9 — дополнение к рисунку 3). В настоящем исследовании пять линий разрушения рецептора ABA pyl-11458 и pyl-12458 были исследованы на газообмен в Dittrich et al., 2019. Однако данные для линий комплементации замыкающих клеток, представленные здесь, были основаны на pyl-11458 , тогда как данные по газообмену в Dittrich et al., 2019 были основаны на комплектации пил-12458 . Уровни экспрессии белков трансгенно экспрессируемых рецепторов могут варьироваться, влияя на интерпретацию. Таким образом, использование линий разрушения генов в настоящем исследовании позволяет сделать более надежные выводы и демонстрирует, что закрытие устьиц, вызванное CO ₂, остается устойчивым после разрушения PYL4 и PYL5 (Рисунок 9 и Рисунок 9 — приложение к рисунку 1). Кроме того, количественные различия в уровнях экспрессии белков трансгенно экспрессируемых рецепторов ABA в замыкающих клетках и условиях роста могут влиять на результат данных устьичного ответа, учитывая актуальность найденных здесь базальных концентраций ABA и активности SnRK2.Большая скорость транспирации у пятикратного мутанта pyl-12458 была снижена за счет экспрессии замыкающих клеток PYL5 (дополнительная фигура 8C в Dittrich et al., 2019), что может быть объяснено ответом на базальную ABA. В соответствии с этой моделью, мы наблюдали замедленное открытие устьиц в pyl-11458 / PYL5 листьях (Рисунок 9 — рисунок в приложении 2D). Устьичные ответы на высокий уровень CO ₂ были затронуты и замедлены у мутантов рецептора ABA более высокого порядка pyr / pyl / rcar (Hsu et al., 2018). Однако данные для комплементации с отдельными рецепторами (Dittrich et al., 2019) могут зависеть от условий роста, поскольку настоящие независимые результаты в наших двух лабораториях (EM и HK lab и JS lab) и предыдущих исследованиях (Merilo et al., 2013 ; Hsu et al., 2018) не могут подтвердить модель, согласно которой PYL4 и PYL5 опосредуют устьичный ответ на CO ₂.

Нормализация часто используется для отображения устьичных ответов мутантов с сильно различающейся устойчивой устьичной проводимостью.Обратите внимание, что помимо сравнения зависимости устьичных ответов от времени, выводы, полученные на основе интерпретации данных нормализованной устьичной проводимости, могут быть неоднозначными. Мутанты, которые реагируют на стимуляцию, но имеют более высокую устьичную проводимость и сохраняют более высокую устьичную проводимость после ответа (что может быть связано с развитием устьиц и отверстиями), могут демонстрировать очевидное снижение чувствительности, когда данные нормализуются до значений до начала стимул. Например, в настоящем исследовании анализ нормализованных данных по устьичной проводимости приведет к неточным выводам: например, когда данные о устьичной проводимости из Рисунка 9 были проанализированы, но в нормализованных относительных единицах, то есть путем деления абсолютного снижения устьичной проводимости на устьичная проводимость в начале повышенного CO ₂, выводы, противоположные анализу ненормализованных данных, могут быть сделаны (Рисунок 9 — рисунок в приложении 1): после нормализации шестиместный мутант PYR / RCAR и пятерка pyl-11458 мутант имел наименьшее нормализованное снижение устьичной проводимости в ответ на повышение CO ₂ (рисунок 9 — приложение к рисунку 1).Однако, в отличие от тех же данных, абсолютные значения устьичной проводимости показывают самые сильные ответы CO ₂ у рецептора ABA pyl-12458, , пятерки и pyl-112458, , шестикратных мутантов (рис. 9A и B, рис. 9 — рис. приложение 1). Эти анализы показывают, что для количественного определения чувствительности устьиц линий растений с различной начальной устьичной проводимостью к стимулам необходимо применять различные кинетические анализы, основанные на ненормированных устьичных проводимости в реальном времени.Отображение как абсолютных, так и нормализованных данных рядом (Hsu et al., 2018) или предоставление значений устьичной проводимости в установившемся состоянии может помочь в разработке более надежных механистических моделей.

В заключение, SnRK2 являются ключевыми протеинкиназами, которые опосредуют реакции на абиотический стресс. В совокупности представленное исследование обеспечивает новый подход к изучению активности киназы SnRK2 в реальном времени и стрессовых реакций в живых интактных растительных клетках и тканях. Репортер SNACS можно использовать для исследования многих моделей передачи сигналов стресса и перекрестных помех между путями (Yoshida et al., 2006; Wang et al., 2018; Такахаши и др., 2020; Lin et al., 2020). Более того, субклеточное нацеливание на SNACS д. Быть интересным для будущих сравнений регуляции протеинкиназы SnRK2, локализованной в клеточных компартментах. Кроме того, мы предоставляем доказательства обратимости SNACS in vivo при ингибировании активности киназы, предполагая, что также можно проанализировать подавление регуляции протеинкиназы SnRK2. Более того, как повышенное содержание CO _2,, так и MeJA не вызывали увеличения коэффициента испускания флуоресценции SNACS, что дает экспериментальные доказательства того, что эти стимулы не усиливают быстро SnRK2.6 / активность OST1 в замыкающих клетках, как обнаружено здесь при анализе в реальном времени. Более того, наши анализы газообмена в интактных растениях и листьях не смогли подтвердить недавно предложенную модель, согласно которой устьичная передача сигналов CO ₂ требует рецепторов PYL4 и PYL5 ABA (Dittrich et al., 2019). Настоящие результаты предоставляют доказательства in vivo механизмов передачи сигнала CO ₂ в устьичной передаче сигналов, которые используют базальную передачу сигналов ABA и базальную активность OST1, но не быстро повышают активность киназы OST1 / SnRK2.

Лучшее программное обеспечение для графического дизайна 2021 года

Графический дизайн — это все о программном обеспечении. Несомненно, талантливый дизайнер может сделать из Microsoft Paint что-нибудь красивое. Но интуитивно понятное управление и гибкость хорошей программы могут иметь решающее значение. Итак, какое программное обеспечение для графического дизайна вам подходит?

Какое программное обеспечение для дизайна вам подходит? Мы внимательно рассмотрим самые популярные варианты. Иллюстрация Владанланда
Для дизайнеров программное обеспечение становится расширением их художественных способностей.Они запоминают сочетания клавиш, знакомятся с раскладками и обычно относятся к своему любимому программному обеспечению как к второму языку. Очень важно иметь интуитивно понятную и гибкую программу.
Итак, какое программное обеспечение для проектирования выбрать? Вы ищете гибкость и дороговизну Photoshop или ищете что-то более простое и недорогое?
Не волнуйтесь. Мы связались с некоторыми из наших любимых дизайнеров, чтобы узнать их мнение о лучшем программном обеспечении для графического дизайна 2021 года.Вот что мы нашли.
Лучшие оплачиваемые программы графического дизайна

—
Adobe Photoshop
Изображение с Engadget
Adobe Photoshop — самая узнаваемая программа для графического дизайна. Когда дело доходит до обработки изображений, Photoshop может делать все, от базовой обрезки, которую могла бы выяснить ваша бабушка, до более сложных растровых дизайнов. Photoshop известен классическими функциями, такими как инструмент «Перо», слои и маски, но в самой последней версии добавлены некоторые интересные приемы, такие как инструмент «Рамка» для легкого маскирования и новое рабочее пространство «Заливка с учетом содержимого».С потенциально безграничным потолком навыков Photoshop — отличный навык графического дизайна для начала.
Когда дело доходит до обработки изображений, Photoshop может все.
Подходит для: редактирования изображений
Стоимость: Adobe теперь предлагает услугу подписки на свои продукты с 30-дневной пробной версией. План фотографии для частных лиц (lightroom, lightroom classic, Photoshop, 20 ГБ облачного хранилища) стоит 9 долларов.99 в месяц, полная стоимость Creative Cloud 52,99 доллара США в месяц. Однако существуют разные цены для студентов и учителей, предприятий и учителей, школ и университетов.
Требуемый уровень квалификации: от начального до продвинутого
Плюсы:
Практически безграничный потолок навыков
Интегрированная стоковая библиотека
Множество дизайнерских инструментов для редактирования изображений
Минусы:
Интерфейс
сложно привыкнуть
Неидеальные обновления
Невозможно создать настоящие векторные файлы
Эскиз
Изображение через Stack Exchange
Sketch — векторный инструмент, доступный только на Mac. Это программа, ориентированная в основном на веб-дизайн, разработку приложений и интерфейсов.Недавно он оказал влияние на конкуренцию в области графического дизайна: некоторые разработчики предпочитают файлы Sketch от дизайнеров, а не многослойные файлы Photoshop. Хотя Sketch не предназначен для редактирования фотографий или печати, он отлично подходит для создания значков и интерфейсов, которые вы увидите на веб-сайтах и в мобильных приложениях. Дизайнеры также могут создавать живые композиции, которые разработчики могут предварительно просмотреть, нажав или пролистывая, чтобы увидеть, как они будут выглядеть после публикации.
Sketch отлично подходит для веб-дизайна, дизайна приложений и интерфейсов.
Подходит для: пользовательских интерфейсов
Стоимость: 99 долларов США в год за устройство
Требуемый уровень квалификации: новичок
Плюсы:
Низкая кривая обучения
Дешевле, чем другие популярные программы
Минусы:
Только Mac
Не подходит для печатных дизайнов или иллюстраций
Adobe Illustrator
Изображение через Digital Arts
В Photoshop и Illustrator есть некоторые общие инструменты и функции, но Adobe Illustrator ориентирован на векторный дизайн.Создавайте красивые логотипы, типографику, значки и наброски с помощью инструментов «Сетка», «Перо», образцов и цветов или инструментов «Форма» и «Обработка контуров» Illustrator. Хотя для изучения потребуется некоторое время, почти безграничный потенциал создания векторных дизайнов стоит затраченных усилий.
В основном я использую Photoshop и Illustrator. Я полностью отказался от ручки и бумаги, я делаю все свои наброски в Photoshop, а затем рисую дизайн в Illustrator, где я также готовлю его для анимации, если это проект.
Подходит для: векторных изображений
Стоимость: Один только Illustrator будет стоить 20,99 долларов в месяц, а полная стоимость Creative Cloud — 52,99 долларов в месяц.
Требуемый уровень квалификации: Продвинутый
Плюсы:
Полезный пользовательский интерфейс
Широкий выбор инструментов
Поддерживает точное редактирование
Минусы:
Affinity Designer
Affinity Designer
С точки зрения функциональности и стиля Affinity Designer представляет собой впечатляющую низкобюджетную альтернативу Adobe Illustrator.Affinity даже хвалят за то, что его проще в использовании и быстрее, чем в Illustrator, особенно при работе со слоями. Его достаточно просто использовать в качестве учебного пособия для новичков, но достаточно эффективно для художников-фрилансеров с ограниченным бюджетом.
Affinity также недавно получила большое обновление с новыми функциями и улучшениями производительности. Это программное обеспечение — отличный вариант для тех, кто не хочет тратить деньги на предложения Adobe, но нуждается в чем-то, что работает на высоком уровне.
Affinity Designer — впечатляющая недорогая альтернатива Adobe Illustrator.
Подходит для: векторных файлов
Стоимость: 49,99 $
Требуемый уровень квалификации: от начального до продвинутого
Плюсы:
Начать работу легко
Быстро
Намного дешевле, чем большие парни
Минусы:
Некоторые инструменты, предлагаемые Illustrator, недоступны
Adobe InDesign
Изображение через Adobe
Adobe InDesign, обязательный для издательского сообщества, используется для оформления журналов и газет с 1999 года.Собирайте потрясающие журналы, информационные листы и брошюры и легко экспортируйте их в PDF или HTML. Хотя InDesign представляет собой своего рода «пони с одной уловкой», у него невысокая кривая обучения, и он отлично подходит для новичков, которые учатся сочетать текст и графику.
InDesign отлично подходит для оформления журналов, открыток, листовок и печати.
Подходит для: макетов публикации
Стоимость: Сам InDesign стоит 20,99 доллара в месяц, а полная версия Creative Cloud стоит 52 доллара.99 / мес.
Требуемый уровень квалификации: от начального до продвинутого
Плюсы:
Бесспорный чемпион издательской индустрии
Интуитивно понятные функции обрезки и изменения размера
Огромный выбор шрифтов
Минусы:
Некоторые претензии к форматированию PDF
Лучшее бесплатное программное обеспечение для графического дизайна

—
GIMP
Изображение через Capterra
Возможно, самый популярный бесплатный редактор растровой графики с открытым исходным кодом, GIMP (программа манипулирования изображениями GNU), имеет многие из тех же функций, что и платные программы.Хотя его макет не так привлекателен, как, скажем, Photoshop, вы все равно получаете расширенные возможности ретуши, рисования и кадрирования фотографий, которые есть в более известных программах.
Подходит для: растровых изображений
Требуемый уровень квалификации: новичок
Плюсы:
Хорошее сообщество
Множество инструментов для бесплатной программы
Минусы:
Не так быстро обновляются, как другие программы
Меньше признания
Не настолько интуитивно понятен в использовании
Gravit Designer
Изображение предоставлено Gravit Designer
Gravit Designer — это бесплатное приложение для векторного дизайна, которое отлично подходит для создания логотипов, обработки фотографий, иллюстраций и анимации.Вы можете использовать Gravit онлайн с их облачным программным обеспечением, хотя в некоторых обзорах утверждается, что оно работает немного медленнее, чем локально установленная версия. Макет гладкий и полностью настраиваемый, но Gravit Designer Pro больше не является бесплатным (49 долларов в год).
Gravit отлично подходит для создания логотипов, обработки фотографий, иллюстраций и анимации.
Подходит для: векторных изображений
Требуемый уровень квалификации: новичок
Плюсы:
Множество функций и возможностей
Облачная программа отличная
Минусы:
Бесплатная версия не так эффективна, как Pro
Inkscape
Изображение с Softonic
В хорошем сообществе есть что-то прекрасное.База пользователей Inkscape полна энтузиазма и полезна благодаря этому кроссплатформенному программному обеспечению, воплощающему лучшее из дизайна с открытым исходным кодом. Пользователи могут создавать красивую графику и дизайн с использованием множества доступных учебных ресурсов. Однако крутая кривая обучения, неуклюжий интерфейс и менее звездная версия для Mac не позволяют Inkscape быть идеальной программой.
Подходит для: векторных изображений и файлов в формате SVG
Требуемый уровень квалификации: продвинутый
Плюсы:
Множество фильтров
Полезный сайт и сообщество
Минусы:
Может работать медленно
Крутая кривая обучения
Вектор
Изображение через Medium
Доступный через веб-браузер или отдельное приложение, Vectr отлично подходит для создания (как вы уже догадались) векторных изображений.Для опытных дизайнеров Vectr, скорее всего, не обладает всеми необходимыми функциями. Но как для обычных людей, так и для любителей такая низкая кривая обучения будет привлекательной. Кроме того, на их веб-сайте есть десятки учебных пособий для новичков.
Новичкам понравится низкая кривая обучения Vectr.
Подходит для: векторных изображений
Требуемый уровень квалификации: новичок
Плюсы:
Очень подходит для начинающих
Хорошая подборка обучающих видео
Минусы:
Немного ограничены в возможностях
Неуклюжий процесс регистрации
Бонусные дизайнерские программы

—

Всегда появляются новые программы, приложения и инструменты, которые помогут дизайнерам с эскизами, моделированием и другими задачами.Вот несколько рекомендаций, рекомендованных нашим сообществом:
Procreate — программа для iPad для рисования на ходу
Изображение предоставлено Digital Arts
Вдохновение пришло во время поездки в метро? Procreate позволяет дизайнерам делать быстрые наброски прямо на ходу. Имея более 130 кистей, это отличный инструмент в арсенале (и стоит всего 9,99 доллара США).
Krita — бесплатный редактор растровой графики с открытым исходным кодом
Изображение с KDE
Бесплатная программа для рисования и рисования, Krita отлично подходит для комиксов и манги и заняла первое место среди бесплатных программ для рисования по версии TechRadar в 2021 году.
Canva — онлайн-редактор с перетаскиванием
Изображение с Canva
Canva — это отправная точка для всех, у кого нет никаких предварительных знаний в области дизайна, и кто хочет создать что-то быстро и легко. Он предлагает широкий выбор шаблонов, шрифтов и изображений, некоторые из которых можно использовать бесплатно, другие нужно покупать. Выбирайте из существующих шаблонов или создавайте собственные с нуля, а затем используйте редактор Canva с перетаскиванием. Конечно, он не предлагает возможности настройки Photoshop, но это отличная альтернатива для абсолютных новичков.Canva использует бизнес-модель freemium, а это значит, что вам нужно будет перейти на профессиональную версию, чтобы получить все навороты.
Scribus — бесплатная альтернатива InDesign
Изображение взято с Zwodnik
Scribus — это настольная издательская программа с открытым исходным кодом. Хотя он и не так красив и обширен, как InDesign, он может стать хорошей заменой, если вы в затруднительном положении.
Autodesk SketchBook — бесплатная программа для создания эскизов
SketchBook Via SketchBook
SketchBook — отличная программа, если вы хотите быстро набросать идеи и создать концептуальные наброски, рисунки и изображения — и это совершенно бесплатно.
Отнеситесь серьезно к своему искусству с идеальным программным обеспечением для графического дизайна

—
Выбрать «лучшее» программное обеспечение для графического дизайна всегда непросто, так как это действительно вопрос личного мнения и зависит от того, что именно вы хотите создать. Каждый дизайнер должен решить для себя, какое программное обеспечение лучше всего подходит для его стиля дизайна, потребностей, среды и, конечно же, клиента.